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Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9252 (2023) Citer cet article

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La maladie de Wilson (WD) est une maladie autosomique récessive à base génétique. Le symptôme non moteur prédominant de la MW est un dysfonctionnement cognitif, bien que le mécanisme de régulation génétique spécifique reste incertain. Les souris Tx-J, avec une homologie de séquence de 82 % du gène ATP7B avec le gène humain, sont considérées comme le modèle le plus approprié pour la MW. Cette étude utilise un séquençage en profondeur pour étudier les différences dans les profils de transcrits d'ARN, à la fois codants et non codants, ainsi que les caractéristiques fonctionnelles du réseau de régulation impliqué dans la déficience cognitive WD. La fonction cognitive des souris tx-J a été évaluée à l'aide du Water Maze Test (WMT). Les longs profils d'ARN non codant (lncRNA), d'ARN circulaire (circRNA) et d'ARN messager (ARNm) ont été analysés dans le tissu hippocampique de souris tx-J pour identifier les ARN différentiellement exprimés (DE-ARN). Par la suite, les DE-ARN ont été utilisés pour construire des réseaux d'interaction protéine-protéine (PPI), ainsi que des réseaux d'expression d'ARN endogène (ceRNA) concurrents associés aux DE-circRNA et aux lncRNA et des réseaux de co-expression codant-non codant (CNC). Pour élucider leurs fonctions et voies biologiques, les réseaux PPI et ARNce ont été soumis à l'analyse des voies Gene Ontology (GO) et Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Un total de 361 ARNm différentiellement exprimés (DE-mRNA), comprenant 193 ARNm régulés positivement et 168 régulés négativement, 2627 ARN longs non codants exprimés différentiellement (DE-lncRNA), composés de 1270 régulés positivement et 1357 régulés négativement Des lncARN et 99 ARN circulaires exprimés de manière différentielle (DE-circARN), composés de 68 circARN régulés positivement et 31 circARN régulés négativement, ont été observés dans le groupe de souris tx-J par rapport au groupe de souris témoins. L'ontologie génique (GO) et les analyses des voies ont révélé que les DE-ARNm étaient enrichis dans les processus cellulaires, les voies de signalisation du calcium et les voies de surveillance des ARNm. En revanche, le réseau d'ARN endogène compétitif associé aux DE-circRNAs (ceRNA) a été enrichi pour la modification covalente de la chromatine, la modification des histones et le guidage des axones, tandis que le réseau de ceRNA associé aux DE-lncRNAs a été enrichi pour la colonne vertébrale dendritique, la régulation de la morphogenèse cellulaire impliquée. dans la différenciation et la voie de surveillance de l'ARNm. L'étude a présenté les profils d'expression de l'ARNlnc, de l'ARNcirc et de l'ARNm dans le tissu hippocampique des souris tx-J. En outre, l'étude a construit des réseaux d'expression PPI, ceRNA et CNC. Les résultats sont importants pour comprendre la fonction des gènes régulateurs dans la DEO associée à une déficience cognitive. Ces résultats offrent également des informations précieuses pour le diagnostic et le traitement de la MW.

La maladie de Wilson (WD) est une maladie autosomique récessive causée par des mutations du transporteur de cuivre ATP7B dans les voies biliaires, provoquant une accumulation excessive de cuivre (Cu) dans les tissus, qui a été introduite par Kinnear Wilson en 19121. Le gène ATP7B est une ATPase de type P qui peut maintenir une bonne concentration de cuivre dans le corps. Les mutations de ce gène conduisent à l'accumulation de cuivre dans divers tissus et organes, dont le foie, le cerveau, la cornée et les reins2. Ainsi, la présentation clinique de la MW varie d'un état asymptomatique à un état hépatique, neurologique, ophtalmique et psychiatrique3. La maladie du foie peut se présenter comme la première manifestation clinique de la maladie de Wilson (WD), avec une gamme de symptômes qui incluent des enzymes hépatiques élevées asymptomatiques, une hépatite aiguë, une hépatite sévère, une cirrhose compensée/décompensée et même une insuffisance hépatique aiguë4. Suite aux manifestations hépatiques, les symptômes neurologiques sont le symptôme clinique le plus courant, qui peut se présenter sous forme de troubles du mouvement à des degrés divers tels que tremblements, dystonie ou parkinsonisme, et de dysfonctionnements non moteurs tels que dysarthrie, dysphagie, troubles psychiatriques, dysfonctionnement cognitif, troubles de la personnalité. , etc.5. Les dépôts de cuivre pathologiques oculaires peuvent également entraîner des manifestations ophtalmologiques typiques de la MW, telles que les anneaux de Kayser-Fleischer et les cataractes de tournesol6. De plus, le dépôt de cuivre dans le cœur peut provoquer des arythmies cardiaques, une cardiomyopathie, etc. ; une maladie rénale peut entraîner un dysfonctionnement tubulaire, des calculs rénaux, une hypercalciurie, etc. ; le système squelettique peut se manifester par l'ostéoporose, le calcium du cartilage, l'arthrose, etc. ; et le système reproducteur féminin peut présenter des menstruations irrégulières, l'infertilité, une fausse couche habituelle, etc.7. Le dysfonctionnement cognitif est le principal symptôme non moteur des systèmes neurologiques. Kirk et al. ont constaté que des troubles cognitifs étaient présents chez plus de la moitié des patients stables atteints de la MW, quel que soit leur phénotype, et persistaient au cours de l'évolution à long terme de la maladie8. En tant que l'une des rares maladies génétiques congénitales traitables, un diagnostic précoce et un traitement rapide de la MW pourraient faciliter un contrôle efficace9.

Dans notre étude, des souris tx-J ont été utilisées comme modèle animal. Selon des recherches menées par Jackson Laboratory, l'accumulation de cuivre dans l'hippocampe a provoqué des troubles du comportement et des troubles de la mémoire chez les souris tx-J10. Des études antérieures ont également confirmé que la suractivation de l'autophagie mitochondriale dans les neurones hippocampiques des souris tx-J peut entraîner un dysfonctionnement cognitif11. En outre, une autre étude a rapporté que 82 % des humains et 91 % des souris tx-J partagent la même séquence d'acides aminés de la protéine WND, qui possède des domaines fonctionnels contenant des ATPases transportant le cuivre12. Par conséquent, les souris tx-J sont un modèle valable pour étudier WD.

L'ARN non codant est un élément brûlant dans le domaine actuel des neurosciences. Ils manquent de fonctions de codage des protéines, alors qu'ils peuvent réguler la transcription et la traduction par la structure de la chromatine13, l'échafaudage ARN/protéine, les modifications spongieuses et épigénétiques, l'épissage sélectif, etc.14. La diversité et la complexité des ARN non codants et des réseaux de contrôle des gènes associés jouent un rôle essentiel dans la régulation des pathologies physiologiques15. Une étude explorant les profils d'expression génique du vieillissement de l'hippocampe a révélé que la dérégulation des immunoglobulines peut être un mécanisme potentiel du vieillissement de l'hippocampe, nécessitant une attention particulière au rôle de l'immunité centrée sur l'hippocampe dans le processus de vieillissement16. Le séquençage complet du transcriptome et l'analyse raffinée peuvent aider à identifier et à étudier les fonctions des ARNnc. En comparaison, les études du réseau ce ARNnc-miARN-ARNm de profils de transcriptome entiers dans le tissu hippocampique de souris tx-J ne sont pas rapportées actuellement.

Cette étude fournit une description des profils d'expression d'ARN codant et non codant dans le tissu de l'hippocampe d'individus atteints de la maladie de Wilson (WD). Nous avons identifié les ARNlnc, circARN et ARNm exprimés de manière différentielle, et construit un nouveau réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) et un réseau de co-expression. De plus, nous avons utilisé des DE-circRNA, des réseaux d'ARNc associés aux lncRNA et une analyse d'enrichissement de la voie GO/KEGG pour prédire de manière exhaustive leurs fonctions. Enfin, nous avons utilisé la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) pour confirmer l'expression des gènes associés à la MW. Nos découvertes contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la MW et des stratégies de diagnostic et de traitement des troubles cognitifs liés à la MW.

Après avoir suivi un programme d'entraînement de quatre jours, les souris ont été soumises à une expérience de croisière de positionnement le cinquième jour. L'expérience consistait à comparer la latence d'échappement et la distance de nage dans le quadrant opposé à la plate-forme entre le groupe WD et le groupe témoin. Les résultats ont indiqué que le groupe WD avait des valeurs significativement plus élevées que le groupe témoin, avec une différence statistiquement significative (Fig. 1a, b). De plus, la latence d'évasion moyenne et la distance totale de nage dans les trois quadrants, à l'exception du quadrant de la plate-forme, ont été comparées entre les deux groupes. Les résultats ont montré que le groupe WD avait des valeurs plus élevées que le groupe témoin, avec une différence statistiquement significative (Fig. 1c, d). Ces résultats suggèrent que, dans les mêmes conditions d'entraînement, les souris tx-J ont besoin de plus de temps et nagent sur de plus longues distances pour trouver la plate-forme, ce qui indique des capacités d'apprentissage et de mémoire spatiales nettement inférieures à celles des souris normales.

Analyse des capacités spatiales d'apprentissage et de mémoire réalisée via des tests MWM. ( a ) Latence d'échappement du quadrant de plate-forme opposé (** P <0, 01). (b) Distance de nage du quadrant de plate-forme opposé (** P < 0,01). ( c ) Latence d'échappement moyenne de trois quadrants à l'exception du quadrant de la plate-forme (* P <0, 05). (d) Distance totale de nage à l'exception du quadrant de la plate-forme (*P < 0,05).

Comme le montre la figure 2, les résultats de la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine ont montré que l'hippocampe dans les cellules pyramidales de la zone CA1 des souris témoins était densément disposé et régulier, avec des noyaux de cellules pyramidales lisses et un feutre nerveux périphérique dense, entrecoupé de quelques cellules gliales, bonne morphologie , et capillaires abondants. En revanche, les cellules pyramidales de l'hippocampe des souris tx-J du groupe WD étaient réduites en nombre, disposées de manière lâche, avec des intervalles cellulaires élargis, des niveaux de cellules pyramidales fortement réduits, un œdème léger, un cytoplasme et des noyaux légèrement colorés, une perte localisée de cellules pyramidales, des des bandes en forme d'anneau autour des cellules et des caractéristiques de mort cellulaire importantes (Fig. 2a). Les résultats de la coloration par immunofluorescence ont montré que par rapport au groupe témoin, le nombre de nouveaux neurones survivants dans le gyrus denté de l'hippocampe dans le groupe WD était significativement réduit (Fig. 2b).

Les changements morphologiques dans l'hippocampe de deux groupes. ( a ) Les résultats de la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (× 400). La flèche sur la figure montre que les cellules pyramidales de l'hippocampe sont œdémateuses, que l'espace cellulaire est élargi et qu'il y a une bande transparente en forme d'anneau autour d'elles, et la mort cellulaire. ( b ) Les résultats de la coloration DAPI, du marquage BrdU et de la fusion des neurones hippocampiques (× 20 μm). La flèche montre une diminution significative du nombre de neurones nouvellement formés dans l'hippocampe du groupe WD.

Nous avons analysé les ARN DE en utilisant la méthode EdgeR, en suivant les critères P < 0,05 et |log2FC|> 1,5. Le diagramme de Venn, le diagramme de volcan et la carte de regroupement ont été utilisés pour montrer les ARN DE, comme illustré à la Fig. 3. Les figures 3a à c indiquent le diagramme de Venn, le diagramme de volcan et la carte thermique de regroupement des DEG. Les figures 3d à f montrent le diagramme de Venn, le diagramme de volcan et la carte thermique de regroupement des DEL. La figure 3g – i indique le diagramme de Venn, le diagramme du volcan et la carte thermique de regroupement des DEC. Des informations détaillées apparaissent dans les tableaux supplémentaires S1, S2, S3. Des informations détaillées sur les 20 principaux DEC / DEL / DEG régulés à la hausse et à la baisse dans l'hippocampe tx-J sont présentées dans les tableaux 1, 2 et 3.

Profils d'expression des ARN DE. ( a – c ) Profils d'expression des ARNm DE. ( d – f ) Profils d'expression des lncARN DE. ( g – i ) Profils d'expression des circARN DE. Le diagramme de Venn (a,d,g), qui est tracé sur Jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html), montre le nombre d'ARN DE chevauchants dans le groupe WD par rapport au groupe de contrôle. Dans les parcelles de volcan (b, e, h) réalisées à l'aide des outils OECloud (https://cloud.oebiotech.com), les points bleus représentent les ARN DE régulés à la baisse, tandis que les points rouges représentent les ARN DE régulés à la hausse. Dans la carte thermique (c, f, i) réalisée avec Heatmapper (http://www.heatmapper.ca/), les rectangles bleus représentent une diminution des ARN DE et les rectangles rouges représentent une augmentation des ARN DE.

Dans l'ensemble, par rapport au groupe témoin, un total de 361 DE-ARNm (193 à la hausse et 168 à la baisse), 2627 DE-lncARN (1270 à la hausse et 1357 à la baisse) et 99 DE-circARN (68 régulation à la hausse et 31 régulation à la baisse) ont été identifiées dans l'hippocampe tx-J.

Étant donné que quatre-vingt-dix-neuf circARN se sont avérés avoir des changements significatifs avec WD dans l'ARN-seq, la fiabilité des résultats est inconnue. Pour confirmer la fiabilité, six circARN avec des changements de pli relativement élevés dans l'ARN-seq ont été sélectionnés au hasard pour la validation qRT-PCR, y compris trois circARN régulés à la hausse (mmu_circ_0001700, mmu_circ_0001662 et mmu_circ_00013859) et trois circARN régulés à la baisse (mmu_circ_0001859, mmu_circ_0000626 et mmu_circ_0000460). Comme présenté à la Fig. 4, les données qRT-PCR montrent que les circARN mmu_circ_0001700 et mmu_circ_0001662 étaient significativement régulés à la hausse, tandis que les circARN mmu_circ_0001859, mmu_circ_0000626 et mmu_circ_0000460 étaient significativement régulés à la baisse dans le groupe WD. Ces résultats étaient cohérents avec l'ARN-seq, ce qui suggère que des données d'ARN-seq sont disponibles.

Validation qRT-PCR des candidats DE-circRNA.

Nous avons construit un réseau PPI basé sur l'interaction des ARNm DE avec les protéines illustrées à la figure 5a. Des informations détaillées sur les interactions sont répertoriées dans le tableau supplémentaire S4. Nous avons résumé les dix principaux gènes pivots avec les valeurs de degré les plus élevées, qui sont Srsf1, Smarca2, Ppp1cc, Tia1, Ngf, Shank3, Ptk2b, Tcf3, Scn1a et Ikzf.

Visualisations du réseau PPI et analyse d'enrichissement fonctionnel des DEG. (a) Le réseau PPI a été identifié à l'aide de Cytoscape (v3.9.1). Plus la valeur du degré est élevée, plus la couleur est foncée. (b) Des analyses d'enrichissement GO des DEG ont été effectuées à l'aide des outils OECloud (https://cloud.oebiotech.cn). ( c ) Les analyses d'enrichissement KEGG des DEG ont été effectuées à l'aide des outils OECloud. ( d ) Des analyses d'enrichissement Reactome de DEG ont été effectuées à l'aide des outils OECloud.

Analyses GO enrichies en processus biologiques incluant l'organisation du cytosquelette des microtubules (GO : 0000226), l'hématopoïèse (GO : 0030097) et le développement de la projection neuronale (GO : 0031175), la composante cellulaire incluant le cytosquelette (GO : 0,005,856), le cytoplasme (GO : 0005737) , et synapse (GO : 0045202), la fonction moléculaire, y compris l'activité de l'activateur de la protéine tyrosine kinase du récepteur transmembranaire (GO : 0030297), la liaison aux protéines (GO : 0005515) et la liaison à l'haptoglobine (GO : 0031720) (Fig. 5b). Voies KEGG enrichies en voie de surveillance de l'ARNm (mmu03015), voie de signalisation du calcium (mmu04020), trypanosomiase africaine (mmu05143) et synapse dopaminergique (mmu04728) et al. (Fig. 5c). L'enrichissement en réactome a été montré sur la figure 5d, comme les complexes de signalisation des recrues p75NTR (R-MMU-209543), le NF-kB est activé et signale la survie (R-MMU-209560) et le NRIF signale la mort cellulaire du noyau (R- MMU-205043). Tous les résultats d'enrichissement ont été affichés dans le tableau supplémentaire S5.

Deux KEGG liés à la neurophysiologie et à la pathologie de l'hippocampe, avec les DEG indiqués, sont illustrés à la Fig. 6, y compris le potentiel à long terme (mmu04720) (Fig. 6a) et la synapse glutamatergique (mmu04724) (Fig. 6b).

Deux KEGG liés à la neurophysiologie et à la pathologie de l'hippocampe et des DEG ont été indiqués dans des citations de la base de données KEGG (www.kegg.jp/feedback/copyright.html.). (a) Potentiel à long terme (mmu04720); (b) Synapse glutamatergique (mmu04724). Le vert représente la régulation négative du gène, tandis que le rouge représente la régulation positive du gène.

Les réseaux de régulation de l'ARN endogène compétitif (ARNce) jouent un rôle crucial dans diverses maladies humaines. Nous avons construit un triple réseau de régulation circRNA-miRNA-mRNA et un lncRNA-miRNA-mRNA basé sur les ARNnc exprimés de manière différentielle ci-dessus. Les parties fonctionnelles et les mécanismes potentiels de ce réseau ont été évalués par une analyse d'enrichissement fonctionnel.

Dans cette étude, nous avons obtenu 75 circARN différentiels, 1216 miARN et 333 ARNm dans le réseau de régulation des ARNce liés aux circARN, comme le montre la figure 7a. Cinq circRNA, dont circRNA.1742, circRNA.3006, circRNA.4795, circRNA.7584 circRNA.9442 ont été considérés comme des circRNA centraux potentiels, et 11 miARN, dont mmu-miR-149-3p, mmu-miR-1946a, mmu- miR-1946b, mmu-miR-328-5p, mmu-miR-3470a, mmu-miR-3470b, mmu-miR-3473b, mmu-miR-3473d, mmu-miR-3547-5p, mmu-miR-6931- 5p et mmu-miR-7045-3p ont été considérés comme des miARN clés (Fig. 7b – d). Nous avons dérivé des paires de gènes de ceRNA apparentés, tels que circRNA 7584/mmu-miR-1946a/Cacna1i, circRNA 7817/mmu-miR-6931-5p/Fosb, etc. Des informations spécifiques sur les réseaux de ceRNA liés au circRNA ont été fournies dans le tableau supplémentaire S6, et des informations détaillées sur 12 algorithmes ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire S7.

La construction de réseaux circRNA-miRNA-mRNA ceRNA affichée par Cytoscape (v3.9.1). ( a ) Réseaux d'ARNc associés à l'ARNcirc. Les nœuds en diamant rouge représentent des circARN significativement différentiels, les nœuds en rectangle bleu représentent leurs miARN prédits et les nœuds en ellipse rose représentent les ARNm prédits. ( b ) Les 10 principaux gènes hub du réseau ceRNA ont été calculés par la méthode Degree. ( c ) Les 10 principaux gènes hub du réseau d'ARNc ont été calculés par la méthode EPC. ( d ) Les 10 principaux gènes hub du réseau d'ARNc ont été calculés par la méthode MCC.

Un réseau d'ARNc associé à l'ARNlnc contenant 2337 ARNlnc, 113 miARN et 330 ARNm, et la carte du réseau contenant les 500 principaux gènes sont présentés à la Fig. 8a. Après calcul, ENSMUST00000145250, ENSMUST00000180800, NONMMUT015424.2 a été considéré comme le lncRNA central, mmu-miR-1195, mmu-miR-1893, mmu-miR-1946a, mmu-miR-3470b, mmu-miR-3473d, mmu-miR -3620-3p, mmu-miR-3960, mmu-miR-5126, mmu-miR-6931-5p ont été considérés comme des miARN hub (Fig. 8b – d). Nous avons identifié plusieurs paires de gènes d'ARNc pouvant jouer un rôle critique, telles que NONMMUT115700.1/mmu-miR-3473d/Mob1b, NONMMUT015424.2/mmu-miR-5126/AL592169.1, ENSMUST00000180800/mmu-miR-5126/Shank3, etc. Des informations spécifiques sur les réseaux d'ARNce liés à l'ARNnc ont été fournies dans le tableau supplémentaire S8, et des informations détaillées sur 12 algorithmes ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire S9.

La construction de réseaux d'ARNlnc-miARN-ARNm affichée par Cytoscape (v3.9.1). ( a ) Réseaux d'ARNc associés à LncRNA. Les nœuds triangulaires violets représentent des lncARN significativement différentiels, les nœuds rectangulaires ronds orange représentent leurs miARN prédits et les nœuds hexagonaux gris foncé représentent les ARNm prédits. ( b ) Les 10 principaux gènes hub du réseau d'ARNc ont été calculés par la méthode du coefficient de clustering. ( c ) Les 10 principaux gènes hub du réseau d'ARNc ont été calculés par la méthode EPC. ( d ) Les 10 principaux gènes hub du réseau d'ARNc ont été calculés par la méthode Stress.

Nous avons effectué une analyse d'enrichissement GO/KEGG en ciblant séparément les ARNm dans deux réseaux d'ARNc. Le réseau d'enrichissement fonctionnel des ARNm ciblant les ARNc associés aux circARN est illustré à la figure 9a. Les résultats GO et KEGG de l'enrichissement fonctionnel de l'ARNm régulé à la baisse ont été démontrés sur les Fig. 9b, c. Analyses GO (Fig. 9b) enrichies en jonction cellulaire (GO : 0030054), projection cellulaire (GO : 0042995), synapse (GO : 0045202), vésicule cytoplasmique (GO : 0031410) et analyses KEGG (Fig. 9c) enrichies en Dépendance aux amphétamines (mmu05031), signalisation adrénergique dans les cardiomyocytes (mmu04261), jonction serrée (mmu04530), etc. Les résultats GO et KEGG de l'enrichissement fonctionnel de l'ARNm régulé à la hausse ont été démontrés sur les Fig. 9d, e. Analyses GO (Fig. 9d) enrichies en cytoplasme (GO : 0005737), liaison aux protéines (GO : 0005515), noyau (GO : 0005634), liaison aux ions métalliques (GO : 0046872) et analyses KEGG (Fig. 9e) enrichies en Voie de signalisation Ras (mmu04014), voie de signalisation PI3K-Akt (mmu04151), infection à Salmonella (mmu05132), etc. Les résultats d'enrichissement ont été affichés dans le tableau supplémentaire S10.

Analyse des réseaux d'enrichissement des ARNm ciblés circARN analysés à l'aide des outils OECloud (https://cloud.oebiotech.com). ( a ) Le réseau d'enrichissement fonctionnel des ARNc ciblant les ARNm associés aux circRNA. (b, c) Le nombre de gènes dans le terme GO / KEGG des ARNm régulés à la baisse ciblant les circARN. ( d, e ) Le nombre de gènes dans le terme GO / KEGG des ARNm régulés à la hausse ciblant les circARN dans l'hippocampe des souris tx-J.

Le réseau d'enrichissement fonctionnel des ARNm ciblant les ARNc associés à l'ARNc est illustré à la figure 10a. Les résultats GO / KEGG de l'enrichissement fonctionnel de l'ARNm régulé à la baisse ont été démontrés sur les Fig. 10b, c. Analyses GO (Fig. 10b) enrichies en activité oxydoréductase (GO : 0016491), liaison aux ions calcium (GO : 0005509), mouvement basé sur les microtubules (GO : 0007018), microtubule (GO : 0005874), membrane plasmique apicale (GO : 0016324 ), et analyses KEGG (Fig. 10c) enrichies en Pathways of neurodegeneration-multiple diseases (mmu05022), Huntington disease (mmu05016), Neuroactive ligand- receiver interaction (mmu05014), etc. Les résultats GO et KEGG de l'ARNm régulé à la hausse l'enrichissement a été démontré sur la Fig. 10d, e. Analyses GO (Fig. 10d) enrichies en régulation de la production de cytokines (GO : 0001817), processus métabolique xénobiotique (GO : 0006805), complexe ubiquitine ligase (GO : 0000151) et analyses KEGG (Fig. 10e) enrichies en protéolyse médiée par l'ubiquitine (mmu04120), Voies de neurodégénérescence-maladies multiples (mmu05022), etc. Tous les résultats d'enrichissement ont été affichés dans le tableau supplémentaire S11.

Analyse des réseaux d'enrichissement des ARNm ciblés des lncARN analysés à l'aide des outils OECloud (https://cloud.oebiotech.com). ( a ) Le réseau d'enrichissement fonctionnel des ARNc ciblant les ARNm associés à l'ARNlnc. ( b, c ) Le nombre de gènes dans le terme GO / KEGG des ARNm régulés à la baisse ciblant les ARNlnc. ( d, e ) Le nombre de gènes dans le terme GO / KEGG des ARNm régulés à la hausse ciblant les ARNlnc dans l'hippocampe des souris tx-J.

Sur la base du coefficient de corrélation de Pearson | r |> 0, 7 et du P <0, 05, nous avons obtenu 2051 paires de gènes co-exprimés circRNA-mRNA, dont 92 circRNA et 397 ARNm, comme le montre la figure 11a. Parmi eux, les cinq circRNA avec la corrélation la plus élevée incluent "circRNA.1641", "circRNA.2061", "circRNA.4258", "circRNA.4898", "circRNA.7366", "circRNA.7621". Les sous-réseaux basés sur des algorithmes sont illustrés aux Fig. 11b–d. Les informations sur les paires circARN-ARNm ont été affichées dans le tableau supplémentaire S12, et des informations détaillées sur 12 algorithmes ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire S13.

Visualisations du réseau et des sous-réseaux de co-expression circRNA-ARNm affichés par Cytoscape (v3.9.1). ( a ) Réseau de co-expression CircARN-ARNm. Les nœuds en diamant rouge représentent les circRNAS. Les nœuds d'éclipse roses représentent les ARNm. ( b ) Les 10 principaux gènes hub du réseau de co-expression circRNA-mRNA ont été calculés par la méthode MCC. ( c ) Les 10 principaux gènes hub du réseau de co-expression circRNA-mRNA ont été calculés par la méthode Radiality. ( d ) Les 10 principaux gènes hub du réseau de co-expression circRNA-mRNA ont été calculés par la méthode Stress.

Nous avons construit un réseau de co-expression ARNlnc-ARNm au même seuil avec 2627 ARNlnc et 361 ARNm sur la figure 12a. Nous avons identifié huit lncRNA comme lncRNA cruciaux, y compris "MSTRG.18029.6", "MSTRG.24543.1", "NONMMUT014183.2", "NONMMUT059281.2", "NONMMUT072370.2", "NONMMUT072383.2", "NONMMUT147148.1" , "NONMMUT148168.1". Les sous-réseaux basés sur les trois algorithmes sont illustrés aux Fig. 12b–d. Les informations sur la paire de gènes lncRNA-ARNm ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire S14, et des informations détaillées sur 12 algorithmes ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire S15.

Visualisations du réseau et des sous-réseaux de co-expression lncRNA-ARNm affichés par Cytoscape (v3.9.1). ( a ) Réseau de co-expression LncRNA-ARNm. Les nœuds triangulaires violets représentent l'ARNlnc. Les nœuds hexagonaux gris foncé représentent les ARNm. (b) La méthode Closeness calcule les cartes d'expression des 10 principaux gènes hub dans le réseau de co-expression lncRNA-mRNA. ( c ) La méthode EPC calcule les cartes d'expression des 10 principaux gènes centraux du réseau de co-expression lncRNA-mRNA. ( d ) La méthode Stress calcule les cartes d'expression des 10 principaux gènes hub dans le réseau de co-expression circRNA-mRNA.

Le travail en cours est la première analyse du transcriptome des circRNAs, lncRNAs et mRNAs dans l'hippocampe du modèle de souris tx-J de WD. Dans ces modèles, les circARN, les lncARN et les ARNm exprimés de manière différentielle sont associés aux mécanismes par lesquels les troubles cognitifs surviennent dans la MW. Nous nous sommes concentrés sur les composants participants des ARN non codants dans le réseau d'ARNce et leurs effets sur les fonctions cellulaires. Nous analysons l'implication caractéristique des ARN non codants dans les réseaux d'ARNc régulant les troubles cognitifs dans la MW, ce qui contribue à explorer des biomarqueurs pour le diagnostic ou le pronostic des troubles cognitifs dans la MW au niveau moléculaire.

Un nombre croissant de preuves suggèrent que la transcription de l'ARN et les modifications du métabolisme sont essentielles au développement de symptômes et de maladies complexes. Les ARN non codants représentent la majorité du transcriptome de l'organisme, qui est abondant dans le système nerveux central et intensément impliqué dans la régulation transcriptionnelle des ARN, étant ainsi associé aux mécanismes de nombreux symptômes et maladies neurologiques17. Plusieurs études ont montré que les ARN codants et non codants régulent la transcription en se liant aux miARN et affectent ainsi l'expression du gène cible en aval, connue sous le nom de mécanisme d'ARN endogène compétitif18. Ce modèle de régulation des gènes peut être utilisé pour expliquer la complexité des espèces ou phénotypique19.

Des études ont montré que jusqu'à 60 % des patients atteints de la MW présentent des symptômes neurologiques ou psychiatriques au moment de la présentation20, y compris des déficits moteurs, cognitifs et comportementaux, et qu'un dysfonctionnement cognitif persistant ou progressif est présent, même chez les patients traités par "désintoxication au cuivre" et les patients atteints de ou sans accumulation de cuivre dans le cerveau21. Comme mentionné précédemment, les souris tx-J sont actuellement un modèle idéal pour étudier le séquençage du transcriptome de WD et des phénotypes apparentés. Dans cette étude, nous avons confirmé la présence de troubles cognitifs chez les souris tx-J grâce à un test de labyrinthe aquatique, y compris une diminution des capacités d'apprentissage spatial et de mémoire. Pendant ce temps, en ce qui concerne l'examen morphologique des structures hippocampiques, les souris modèles tx-J ont montré la destruction des cellules neuronales dans la région du gyrus denté de l'hippocampe. Ils ont considérablement réduit le nombre de nouvelles cellules neuronales. Cela indique qu'il existe une déficience cognitive détectable chez les souris tx-J par rapport aux témoins. D'une part, cette preuve de troubles cognitifs peut améliorer la scientificité des modèles animaux et renforcer la fiabilité des résultats de séquençage.

Dans cette étude, nous avons effectué l'analyse de l'expression différentielle de l'ARNm \ circRNA \ lncRNA, construit un réseau d'expression PPI, et le réseau de co-expression d'ARNc lié à l'ARNc et le réseau de co-expression ARNc / ARNm dans le tissu hippocampique des souris WD modèle tx-J pour la première fois. Nous avons examiné 361 DEG. Beaucoup de ces gènes cibles exprimés de manière significativement différentielle sont étroitement associés à la pathologie des troubles cognitifs. Nous avons constaté que certains ARNm ciblés par les miARN dans les réseaux régulateurs d'ARNc associés aux ARNnc étaient également des ARNm exprimés de manière différentielle, tels que Fosb, Shank3 et Cacna1i, etc.

Fosb est un facteur de transcription dépendant de l'activité qui s'accumule et est retenu au cours de l'activité cellulaire chronique en raison de sa longue demi-vie22. Fosb joue un rôle essentiel dans la régulation de la mémoire hippocampique ; Des études ont confirmé que la famille Fosb régule de nombreuses cibles liées à la dépendance de gènes cibles cruciaux par le biais de modifications d'histones23. Il a également été démontré que la surexpression de Fosb dans l'hippocampe peut affecter l'apprentissage et la mémoire24. Une étude examinant la régulation Fosb de l'expression génique chez des souris modèles AD présentant un dysfonctionnement cognitif suggère que Fosb peut supprimer l'expression de c-Fos, un gène précoce critique pour la plasticité et la cognition, en se liant aux promoteurs et en déclenchant la désacétylation des histones et que la longue demi- la durée de vie de Fosb en fait une cause possible de la persistance des déficits cognitifs25. En tant que protéine d'échafaudage postsynaptique excitatrice, SHANK3 agit sur diverses protéines de densité postsynaptiques pour réguler les récepteurs des neurotransmetteurs postsynaptiques et les molécules de signalisation26. Une étude basée sur la prédiction des niveaux de variants monogéniques dans les troubles du spectre autistique (TSA) a montré que les niveaux d'ARNm de SHANK3 affectent la transmission synaptique dans l'hippocampe des souris, entraînant une possible dépression à long terme et une altération à long terme de l'apprentissage et de la mémoire27. Il a été constaté que le gène CACNA1I (Cav3.3) du canal calcique voltage-dépendant (Cav) est considéré comme un facteur de risque de schizophrénie et que des variantes de ce gène entraînent une perturbation de l'excitabilité neuronale et de l'activité du réseau cérébral, affectant des processus tels que la libération de transmetteur , sensation, mémoire et sommeil28.

L'ARN non codant est une classe de molécules d'ARN qui ne codent pas pour les protéines et représentent environ 98 à 99 % de l'ARN total dans les génomes de mammifères29. Il est de plus en plus évident que les ARN non codants jouent un rôle régulateur important en interagissant activement avec d'autres molécules ; par exemple, un ARN non codant interagit avec une ou plusieurs molécules cibles pour réguler les cellules ou les voies afin d'affecter les processus physiologiques ou pathologiques normaux, y compris la régulation des maladies neurologiques30. Les circARN sont une classe de molécules cycliques monocaténaires fermées de manière covalente sans coiffes 5' ni queues polyadénylées en 3'31, qui sont stables, abondantes et conservées32 et ont un potentiel unique pour la recherche médicale. Dans cette étude, nous avons identifié le profil des circARN dans le tissu de l'hippocampe avec WD, et 99 DEC significatifs ont été éliminés. En particulier, mmu_circ_0001859 et mmu_circ_0000242 étaient fortement liés au guidage axonal, à la voie de signalisation Wnt, à la voie de signalisation du calcium, à la voie de signalisation MAPK, à l'adhésion focale, à la voie de signalisation de la neurotrophine, à la voie de signalisation TGF-bêta, au cycle cellulaire, à la voie de signalisation ErbB, à la voie de signalisation Notch, p53 voie de signalisation, phagocytose médiée par Fc gamma R, etc.

Des études ont confirmé les fonctions biologiques des circARN, telles que la participation à la régulation transcriptionnelle dans le noyau, agissant comme adsorbeurs endogènes des miARN, modèles pour la traduction des protéines ou des peptides et régulateurs de l'expression des gènes33. L'ARNcirc est exceptionnellement abondant dans le cerveau des mammifères, qui est régulé positivement au niveau global lors de la différenciation neuronale, hautement enrichi en neurosynapses et joue un rôle vital dans le développement de troubles neuropsychiatriques34. Une étude basée sur une analyse approfondie de la séquence d'ARN a systématiquement élucidé le mécanisme crânien de l'ARNc associé au circARN chez une souris modèle AD (souris APP / PS1) et a révélé que le réseau d'ARNc associé au circARN chez cette souris modèle est principalement impliqué dans le développement dendritique et la mémoire ( Sorbs2) et le neurodéveloppement de la souris (ALS2), qui fournit de nouvelles idées pour le diagnostic clinique et le traitement de AD35. La première exploration des profils d'expression de circRNA hippocampique chez des souris âgées atteintes de POCD suggère que le réseau de ceRNA mmu_circRNA_22058 et circRNA_44122\Egfr ou le réseau de ceRNA circRNA_22673\Prkacb pourrait avoir une implication significative dans l'évolution de la maladie POCD36. Dans cette étude, nous avons identifié 99 circARN exprimés de manière significativement différentielle dans le tissu hippocampique de souris WD modèle tx-J par rapport aux témoins. Nous avons construit un réseau d'ARNc basé sur des circARN exprimés de manière différentielle et effectué une analyse d'enrichissement fonctionnel. Nous avons effectué des analyses GO et KEGG sur les gènes régulés à la hausse et à la baisse des réseaux d'ARNc associés à l'ARNcirc, respectivement, et avons identifié une série de termes enrichis associés aux maladies neurologiques et aux processus cognitifs. Dans nos résultats, le GO des gènes régulés positivement était enrichi dans le cytoplasme (GO : 0005737), la liaison aux protéines (GO : 0005515), le noyau (GO : 0005634) et la liaison aux ions métalliques (GO : 0046872). En revanche, KEGG a été enrichi dans la voie de signalisation Ras (mmu04014), la voie de signalisation PI3K-Akt (mmu04151), la voie de signalisation Calcium (mmu04020), etc. GO de gènes régulés à la baisse ont été enrichis en jonction cellulaire (GO : 0030054), projection cellulaire (GO : 0042995), synapse (GO : 0045202) et vésicule cytoplasmique (GO : 0031410), et KEGG a été enrichi en dépendance aux amphétamines (mmu05031), signalisation adrénergique dans les cardiomyocytes (mmu04261), jonction serrée (mmu04530), circadien entraînement (mmu04713). Nous avons identifié plusieurs réseaux d'ARNc pouvant contribuer à la progression des troubles cognitifs dans la MW. Par exemple, dans le réseau d'ARNc avec mmu-miR-6931-5p comme noyau et Fosb comme gène cible, les 44 circARN en amont peuvent se lier à mmu-miR-6931-5p comme une éponge pour réguler l'expression des gènes cibles Fosb.

Contrairement aux circRNA, les LncRNA ont une longueur supérieure à 200 nucléotides qui ont des capuchons d'extrémité 5 'et des queues multimériques d'extrémité 3' de sorte qu'ils sont facilement reconnus par le séquençage d'ARN à base d'oligonucléotides37. L'expression des lncRNAs dans le cerveau est spécifique aux tissus38, et des études ont confirmé la présence de modèles d'expression régionaux et spécifiques aux cellules des lncRNAs dans les régions cérébrales cognitivement pertinentes telles que l'hippocampe, le cortex préfrontal et l'amygdale39, telles que lncRNA Gm9968, qui est considérablement enrichi en tissu d'hippocampe de souris, joue un rôle important dans des maladies telles que la maladie d'Alzheimer et l'épilepsie. De nombreux lncRNAs ayant une pertinence cognitive dans des modèles in vivo ou in vitro ont été démontrés. Par exemple, LncRNA Rian peut réduire l'expression de LIMK1 en régulant négativement miR143-3p. Ainsi la modulation de l'axe LncRNA Rian/miR143-3p/LIMK1 peut améliorer le dysfonctionnement cognitif après anesthésie au sévoflurane40. Une étude sur le mécanisme d'action de LncRNA MEG3 sur la fonction cognitive chez des rats modèles AD a montré que la régulation à la hausse de LncRNA MEG3 inhibait les dommages neuronaux, réduisait l'expression positive d'Aβ et améliorait les indices inflammatoires chez les rats AD, améliorant également la fonction cognitive41. Dans les modèles murins de déficience cognitive vasculaire, le LncRNA TUG1 peut se lier et interagir avec les protéines BDNF, et sa surexpression peut entraîner un dysfonctionnement cognitif chez la souris après VCI42. Nous avons identifié 2627 DEL dans le tissu hippocampique de souris modèles WD tx-J et effectué une analyse d'enrichissement fonctionnel dans les ARNce construits associés à l'ARNlnc. Parmi eux, les gènes cibles régulés positivement GO ont été enrichis dans la régulation de la production de cytokines (GO : 0001817), le processus métabolique xénobiotique (GO : 0006805), le complexe ubiquitine ligase (GO : 0000151), l'endosome tardif (GO : 0005770), l'ubiquitine- activité enzymatique de conjugaison (GO : 0061631), activité corépresseur de la transcription (GO : 0003714), enrichissement KEGG dans la protéolyse médiée par l'ubiquitine (mmu04120), voies de neurodégénérescence - maladies multiples (mmu05022). L'expression régulée à la baisse des gènes cibles GO est enrichie en activité oxydoréductase (GO : 0016491), liaison aux ions calcium (GO : 0005509), mouvement basé sur les microtubules (GO : 0007018), microtubule (GO : 0005874), membrane plasmique apicale (GO : 0016324), cil (GO : 0005929). L'analyse KEGG est enrichie en Voies de neurodégénérescence - maladies multiples (mmu05022), Maladie de Huntington (mmu05016), Sclérose latérale amyotrophique (mmu05014), Interaction neuroactive ligand-récepteur (mmu04080). Par exemple, dans le réseau de ceRNA ciblant SHANK3, l'lncRNA supérieur NONMMUT015424.2 (lncRNA D130020L05Rik) peut utiliser mmu-miR-5126 comme éponge pour réguler l'expression transcriptionnelle de SHANK3 en se liant à lui. Notre modèle de réseau prédit ARNnc-ARNce peut contribuer au développement de troubles cognitifs dans la MW, et la fonction de ces réseaux nécessite une validation expérimentale supplémentaire.

L'étude présentée dans cet article présente plusieurs limites. Premièrement, la petite taille de l'échantillon peut limiter la généralisation des résultats. De plus, les résultats obtenus à partir de modèles animaux peuvent ne pas être entièrement représentatifs du profil transcriptionnel de tous les phénotypes de la maladie de Wilson (WD), y compris les souris femelles et les patients humains. Deuxièmement, l'évaluation de l'apprentissage spatial et de la mémoire chez la souris n'a peut-être pas été suffisamment complète. En outre, cette étude a uniquement étudié le profil transcriptionnel de l'hippocampe dans le modèle animal WD, et d'autres tissus de dépôt de cuivre n'ont pas été examinés, ce qui signifie qu'il n'a pas été possible d'étudier l'expression des gènes dans différents tissus. De plus, les résultats de l'étude manquent de validation expérimentale, y compris les gènes présentant des différences d'expression significatives et des modèles de réseau prédictifs, ce qui nécessite des expériences robustes pour fournir des preuves des résultats. Bien que notre étude éclaire les mécanismes des troubles cognitifs dans la MW basés sur la transcriptomique, nous reconnaissons que le mécanisme de régulation de l'expression des molécules de transcription est complexe et nécessite des recherches supplémentaires, telles que la régulation de la modification épigénétique.

En conclusion, l'étude des mécanismes phénotypiques pathologiques des maladies est une entreprise difficile et chronophage. Cependant, l'avancement de la technologie de séquençage à haut débit a considérablement facilité l'exploration des mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies. Notre examen du réseau d'interaction protéine-protéine (PPI) et du réseau d'ARN endogène en compétition avec l'ARN non codant (ARNnc-ARNc) dans le tissu hippocampique des souris tx-J, un modèle de la maladie de Wilson (WD), a des implications importantes pour l'identification biomarqueurs potentiels et valeurs cibles essentielles pour diagnostiquer, traiter et développer des médicaments pour les troubles cognitifs de la MW.

L'étude a utilisé dix souris mâles tx-J (C3HeB/FeJ-Atp7b tx-J/J) pesant 20 ± 2 g et dix souris mâles de type sauvage (C3HeB/FeJ) âgées de 8 à 10 semaines, acquises auprès du Jackson Laboratory via Beijing Vital River Laboratory Animal Technology, Ltd. Toutes les souris ont été logées individuellement dans des cages à humidité contrôlée (50–70%), à température ambiante (18–22 °C) et à alimentation en air séparée, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau sous un cycle alterné lumière/obscurité de 12 h pendant huit semaines. Pour cette étude, il y avait un chevauchement des sous-groupes d'animaux ; trois des quatre souris tx-J ont subi un séquençage à haut débit après les tests MWM, quatre des sept souris restantes ont subi des tests d'histopathologie hippocampique et les trois autres ont subi des expériences de qRT-PCR. Les souris de type sauvage ont également été traitées selon ce protocole. Il a été démontré que les œstrogènes influencent la neuroplasticité dans plusieurs régions du cerveau, régulent et interviennent dans les synapses neuronales et la formation de l'hippocampe, et affectent l'apprentissage et la mémoire43. Ainsi, des souris mâles ont été choisies comme sujets de recherche pour minimiser ces effets.

Les méthodes utilisées dans cette étude ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes des directives ARRIVE2.044. Le Comité d'éthique des animaux expérimentaux de l'Université de médecine traditionnelle chinoise d'Anhui a examiné et approuvé le protocole d'utilisation des animaux (numéro de permis : AHUCM-mouse-2021125).

L'expérience du labyrinthe aquatique de Morris est couramment utilisée pour évaluer les capacités d'apprentissage spatial et de mémoire chez les rongeurs, qui consistaient en une piscine circulaire noire (50 cm de haut et 90 cm de diamètre) remplie d'eau de 45 cm de haut à 21–23 ° C et mélangée avec un colorant blanc non toxique et inodore, dans lequel une table circulaire noire fixée à 1 cm sous l'eau au centre du quatrième quadrant. Quatre souris de chacun des deux groupes ont été sélectionnées pour l'expérience. Dans l'expérience de navigation de positionnement, les deux groupes de souris ont été placés dans l'eau à partir d'un angle de 45° face au mur de la piscine dans l'un des quatre quadrants est, ouest, sud et nord et testés quatre fois par jour. Si les souris montaient sur la plate-forme cachée dans les 60 s et restaient sur la plate-forme pendant plus de 5 s, elles étaient considérées comme ayant trouvé la plate-forme. Le temps écoulé entre l'entrée dans l'eau et la découverte de la plate-forme a été enregistré comme latence d'échappement. Si les souris ne trouvaient pas la plate-forme dans les 60 s, elles étaient guidées vers la plate-forme et y restaient pendant 10 s, et la latence d'échappement était enregistrée à 60 s. Comparez la latence d'échappement du quadrant de plate-forme opposé, la latence d'échappement moyenne de trois quadrants à l'exception du quadrant de plate-forme, la distance de nage du quadrant de plate-forme opposé et la distance de nage totale à l'exception du quadrant de plate-forme le cinquième jour entre les deux groupes .

Quatre souris de chaque groupe ont été sélectionnées pour l'histopathologie de l'hippocampe. Des souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (2 mL/kg ; Shanghai Chemical Reagent Company) après un jeûne de 12 h et ont prélevé des tissus d'hippocampe bilatéraux, fixés avec du paraformaldéhyde à 4 %, déshydratés dans de l'éthanol et du xylène, inclus dans de la paraffine claire, sectionnés, retardé, coloré à l'hématoxyline-éosine, déshydraté davantage et scellé, et observé au microscope optique.

Après avoir isolé le tissu de l'hippocampe dans les groupes WD et témoin sur des glacières, nous avons effectué un séquençage en profondeur d'échantillons d'ARN ribosomique provenant de l'hippocampe de trois souris témoins et de trois souris tx-J.

L'ARN total des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) a été préparé à l'aide du kit MiRNeasy Mini (Qiagen, Allemagne). Ensuite, le kit RNA Clean XP (Cat # A63987, Beckman Coulter, USA) et le RNase-Free DNase Set (Cat # 79254, Qiagen, Allemagne) ont été utilisés pour purifier l'ARN total. L'ARN purifié a été quantifié à l'aide de deux instruments de détection du contenu et de la qualité de l'ARN : NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, USA) et un Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, USA). Selon les instructions du fabricant, les bibliothèques ont été préparées à l'aide du kit de préparation d'échantillons d'ARN total de chaîne truseq® (Illumina, USA). Le fluorimètre Qubit 2.0 a été utilisé pour quantifier la bibliothèque. De plus, ces bibliothèques ont été vérifiées par Agilent 2100 Bioanalyzer. Après confirmation de la taille et de la concentration molaire du fragment inséré, les librairies ont été diluées à 22h avec du CBOT pour générer des clusters et séquencées sur Illumina HiSeq 2500 (Illumina, USA). La bibliothèque a été construite et séquencée chez OG Biotech Inc (Aoji Biotech, Shanghai, Chine).

En utilisant FastQC (v. 0.11.3, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)45, les lectures d'ARN-Seq ont été quantifiées. Seqtk (https://github.com/lh3/seqtk) supprime la séquence d'adaptation d'Illumina TruSeq, les lectures d'ARN ribosomal mm10 et les lectures de faible qualité. Ensuite, à l'aide de Hisat2 (version : 2.0.4), les lectures coupées ont été mappées sur le génome de référence de la souris (mm10) téléchargé à partir d'Ensembl. Le nombre de chaque gène dans les lectures alignées a été détecté par StringTie (version 1.3.0). Avec le script Perl, la normalisation du nombre de gènes et des fragments par kilobase de transcrit par million de lectures cartographiées (FPKM) a été effectuée.

Pour les circARN, toutes les données de séquençage valides ont été traitées en suivant les étapes suivantes : 1) Les données ont été alignées sur le génome de la souris (http://genome.ucsc.edu/)46 par le logiciel BWA-MEM (version : 2.0.4) ; 2) Les lectures alignées de manière contiguë sur les génomes ont été rejetées ; 3) Les lectures non cartographiées ont été analysées explicitement pour les sites de jonction de rétro-épissage à l'aide d'algorithmes CIRI pour identifier les circARN possibles47 et les comptages ont été normalisés par SRPBM (Spliced Reads Per Billion Mapping). Les gènes générant des circARN individuels ont été identifiés en faisant correspondre les emplacements génomiques des circARN à ceux détectés par TopHat/Cufflinks à l'aide des outils BED48. La conservation du circRNA entre les humains et les souris a été analysée à l'aide de l'outil UCSC Liftover. Il a été utilisé pour cartographier les coordonnées des flancs 3' et 5' de chaque circARN dérégulé aux coordonnées du génome humain. Le critère d'homologie était de détecter les sites d'épissage à une distance de ± 2 nucléotides autour des sites humains putatifs49.

Pour l'identification des lncARN, des lectures appariées à voie unique de 2 × 150 pb (PE150) de longueur ont été assemblées à l'aide du logiciel d'assemblage de transcrits StringTie pour supprimer les ARNm connus et les transcrits <200 pb de longueur. Le logiciel de prédiction : Coding Potential Calculator (https://github.com/biocoder/cpc) et Coding Non-Coding Index (https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI#install-CNCI) pour la prédiction des lncRNA des transcrits restants ont ensuite été filtrés à partir de l'ensemble de données lncRNA. Les niveaux d'expression des lncRNA ont été mesurés par des fragments par kilobase de modèle d'exon par million de lectures cartographiées (FPKM), et l'abondance d'expression de gènes connus dans différents échantillons a été calculée à partir des valeurs FPKM.

La méthode EdgeR a été utilisée pour déterminer les gènes différentiellement exprimés, P < 0,05 et |log2FC|> 1,5. Le diagramme de Venn est tracé sur Jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)50. La carte du volcan a été réalisée à l'aide des outils OECloud sur https://cloud.oebiotech.com. La carte thermique a été réalisée sur Heatmapper (http://www.heatmapper.ca/)51.

La qRT-PCR en temps réel a été réalisée dans le système de réaction suivant : 3,6 μL de H2O sans RNase, 0,2 μL d'amorce directe (5 μM), 0,2 μL d'amorce inverse (5 μM), 1 μL de matrice d'ADNc et 5 μL de supermélange vert SYBR (Abclonal, Wuhan, Chine) à 95 ° C pendant 30 s, suivi d'une réaction de 15 s, puis mis à réagir à - 60 ° C pendant 15 s et 70 ° C pendant 15 s, en cyclant 40 fois. Les amorces ont été conçues et synthétisées par OG Biotech Inc (Aoji Biotech, Shanghai, Chine). Les niveaux d'expression relatifs des circARN ont été représentés par 2−∆∆CT.

La base de données STRING (https://cn.string-db.org/) est une base de données intégrée qui fournit des informations sur les interactions protéine-protéine, y compris non seulement les interactions expérimentales mais également les interactions prédites, qui ont été utilisées pour prédire l'interaction de DE ARNm avec des protéines. Cytoscape (v3.9.1) est utilisé pour construire le réseau PPI. En utilisant le plugin MCAO avec les jeux standards, les modules du réseau PPI ont été identifiés avec Cytoscape. L'analyse de l'enrichissement des voies GO et KEGG a été réalisée à l'aide des outils OECloud (https://cloud.oebiotech.cn). Visualisez les DEG et les chemins associés via le site Web Pathview (https://pathview.uncc.edu/).

Toutes les séquences de miARN dérivés de souris ont été obtenues à partir de miRBase version 2152. Le logiciel personnalisé d'OG-Biotech, basé sur le logiciel miRanda et RNAhybrid, a été adopté pour prédire les cibles de miARN qui peuvent interagir avec les DEC et les DEL.

Le nombre de miARN de liaison prédits a été compté pour tous les circARN. La cible d'ARNm pour les miARN de liaison prédits a été collectée à partir de la base de données miRdana53, targetScan54 et mirTarbase55. Le Venny a été utilisé pour obtenir une cible d'ARNm fortement soutenue prédite par au moins deux bases de données. Les DEC et les ARNm qui partagent le même site de liaison aux miARN représentaient les interactions circARN-miARN-ARNm.

Pour le rôle agissant en cis des lncRNA agissant sur les gènes cibles voisins, les gènes codant 10 kb/100 kb en amont et en aval des lncRNA ont été recherchés et leurs fonctions analysées. Pour le rôle agissant en trans des lncRNA, identifié sur la base du niveau d'expression, la corrélation exprimée entre les lncRNAs et les gènes codants a été calculée avec la fonction R "cor. test". Le réseau de ceRNA a été affiché visuellement par le logiciel Cytoscape.

Les gènes hub sont calculés et affichés à l'aide des algorithmes pertinents du plugin Cytohubba56. Ces 12 algorithmes comprennent le degré, le composant percolé par les bords (EPC), le composant de voisinage maximal (MNC), la densité du composant de voisinage maximal (DMNC), la centralité maximale de la clique (MCC) et six centralités (goulot d'étranglement, excentricité, proximité, radialité, intermédiarité, et contrainte) basée sur les chemins les plus courts et le coefficient de regroupement. Tous les algorithmes et les diagrammes de réseau résultants sont présentés dans les figures supplémentaires. S1 et S2.

Pour l'analyse GO, les analyses du processus biologique (BP), du composant cellulaire (CC) et de la fonction moléculaire (MF) ont été effectuées. Pour mieux comprendre la fonction des DE circ-/lnc-/ARNm, les voies enrichies de Gene Ontology (GO) et Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ont été analysées à l'aide des outils OECloud (https://cloud.oebiotech.com) pour révéler la fonction et l'utilité de haut niveau du transcriptome des souris tx-J, telles que les cellules, les organismes et les écosystèmes. Les termes d'enrichissement significatifs pour GO et les voies ont été choisis en fonction du seuil de P <0,05.

Sur la base des données matricielles des DEL/DEC/DEG, les coefficients de corrélation de Pearson entre DEL/ARNm et DEC/ARNm ont été calculés, respectivement, et la valeur seuil de |r|> 0,7 et P < 0,05 pour obtenir un up-/down -liste de co-expression régulée entre DEL/ARNm et DEC/ARNm. La visualisation du réseau de co-expression a été calculée et affichée à l'aide des 12 algorithmes du plugin cytohubba. Tous les algorithmes et les diagrammes de réseau résultants sont présentés dans les figures supplémentaires. S3 et S4.

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de Graphpad Prism 8 (Chicago, USA). Les résultats sont présentés sous forme de moyenne ± écart type (SD). Le test t de Student a été effectué sur les données restantes et P < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Les données de séquence brutes rapportées dans cet article ont été déposées dans le Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) du National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences57,58. Les séquences au format suivant : https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/browse/CRA010567 et le lien de travail vers le bioprojet sous la forme https://ngdc.cncb.ac.cn/bioproject/browse/PRJCA012480.

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Centre d'encéphalopathie, Premier hôpital affilié de l'Université de médecine chinoise d'Anhui, No. 117 Meishan Road, Shushan District, Hefei, 230031, République populaire de Chine

Daojun Xie, Juan Zhang, Bo Yang, Lei Zhou et Xiaofeng Huang

Collège de médecine chinoise et occidentale intégrée, Université de médecine chinoise d'Anhui, No. 1 Qianjiang Road, Xinzhan District, Hefei, 230012, République populaire de Chine

Dan Wang et Biao Cai

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DJX, JZ, BC, BY, LZ, XFH et DW ont conçu l'idée ; DW et XFH ont effectué des recherches dans la littérature ; DW a réalisé des expériences et du matériel sur des animaux; DW a rédigé le manuscrit avec l'aide de DJX, JZ, BCDW a dessiné la figure et corrigé les références avec l'aide de BY, LZ, XFH Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Daojun Xie.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Wang, D., Xie, D., Zhang, J. et al. Analyse complète des profils d'expression du transcriptome d'ARN codant et non codant du tissu de l'hippocampe dans le modèle animal tx-J de la maladie de Wilson. Sci Rep 13, 9252 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36503-8

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Reçu : 29 septembre 2022

Accepté : 05 juin 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36503-8

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