SRAS | Chuzhou Recherche Chimique Inc.

Communications Biology volume 6, Article number: 556 (2023) Citer cet article

624 accès

6 Altmétrique

Détails des métriques

Depuis l'émergence des variantes d'Omicron fin 2021, elles sont rapidement devenues les variantes dominantes au niveau mondial. Les variantes d'Omicron peuvent être transmises plus facilement par rapport à l'ancien Wuhan et aux autres variantes. Dans cette étude, nous avons cherché à élucider les mécanismes de l'infectivité altérée associée aux variantes d'Omicron. Nous avons évalué systématiquement les mutations situées dans la séquence S2 de la pointe et identifié les mutations responsables de la fusion virale altérée. Nous avons démontré que les mutations près du site de clivage S1/S2 diminuent le clivage S1/S2, entraînant une réduction de la fusogénicité. Des mutations dans les séquences HR1 et d'autres séquences S2 affectent également la fusion cellule-cellule. Sur la base d'études de résonance magnétique nucléaire (RMN) et de modélisation in silico, ces mutations affectent la fusogénicité éventuellement à plusieurs étapes de la fusion virale. Nos résultats révèlent que les variants d'Omicron ont accumulé des mutations qui contribuent à réduire la formation syncytiale et donc une pathogénicité atténuée.

La variante Omicron BA.1 du SRAS-CoV-2 a été signalée pour la première fois en Afrique du Sud fin 2021 et est rapidement devenue une variante dominante préoccupante (VOC) au début de 20221. Des données récentes ont montré qu'elle est corrélée à des cas plus élevés. nombres et réponses plus faibles aux anticorps neutralisants1. Il existe cinq COV, dont Alpha (B.1.1.7), Beta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2) et Omicron (à l'origine B.1.1.529, reclassé en BA lignées) ainsi que deux variants d'intérêt (VOI) dont Lambda (C.37) et Mu (B.1.621) basés sur l'Organisation mondiale de la santé à partir de décembre 20212. Parmi les COV, le variant BA.1 et les variants apparentés ( BA.2, BA.4, BA.5) sont apparus comme les variantes circulantes dominantes en 2022 et portent plus de 30 mutations dans sa protéine de pointe. Pour BA.1, plus de 20 mutations existent dans le domaine N-terminal et le domaine de liaison au récepteur (RBD). Les 5 mutations suivantes (T547K, D614G, H655Y, N679K, P681H) sont localisées dans le sous-domaine 1/2 ou à proximité du site de clivage S1/S2 (R685) et les 6 dernières mutations (N764K, D796Y, N856K, Q954H, N969K, et L981F) sont positionnés autour du site de clivage S2' (R815) et de la région HR1 (répétition heptadique 1)3.

Il a été rapporté que les protéines de pointe des variantes B.1.1.7 et B.1.617.2 sont plus efficaces dans la fusion cellule-cellule par rapport à la souche Wuhan en raison de mutations situées près du site de clivage de la furine qui améliorent le clivage S1/S2 efficacité4,5. La pathogénicité plus élevée des variants B.1.1.7 et B.1.617.2 est associée à une formation syncytiale plus efficace car la formation syncytiale induite par le virus a été liée à la pathogenèse et à la gravité de la maladie6. D'autre part, BA.1 semble être cliniquement plus infectieux que les autres COV et des données récentes ont révélé que la variante BA.1 a un taux de réinfection et de percée vaccinale plus élevé, probablement en raison de sa résistance aux anticorps neutralisants préexistants1, 7. Fait intéressant, la variante BA.1 est associée à une maladie moins grave que la variante B.1.617.28. Sur la base de la relation entre la formation syncytiale et la pathogenèse, il a été émis l'hypothèse que la variante BA.1 pourrait avoir une capacité de formation syncytiale inférieure. Cependant, des études ultérieures concernant la formation syncytiale ont été controversées9,10. Étant donné que les mutations près du site de clivage de la furine des variantes B.1.1.7 et B.1.617.2 ont amélioré l'efficacité du clivage S1/S2, nous émettons l'hypothèse que la formation syncytiale réduite de la variante BA.1 peut être le résultat de mutations près du site de clivage de la furine. résultant en un clivage S1/S2 moins efficace.

Des études récentes ont signalé des mutations affectant les épitopes des anticorps neutralisants et le RBD de la protéine de pointe dans les variantes de BA.111,12. Ici, nous avons examiné les propriétés biologiques des variantes de BA.1 et nous nous sommes concentrés principalement sur la fusion médiée par les pointes à l'aide d'essais de fusion cellule-cellule. Nous avons montré que la formation syncytiale atténuée n'est pas seulement due à des mutations près du site de clivage de la furine, mais également à des mutations dans et autour de la région HR1. Alors que de nombreuses mutations affectent le clivage S1/S2, certaines mutations dans la région HR1 semblent affecter directement le processus de fusion induit par le virus. Ensemble, ces mutations expliquent de manière plausible le phénotype pathogène altéré des variants BA.1.

Les séquences de protéines de pointe alignées de toutes les variantes majeures du SRAS-CoV-2 montrent que de nombreuses mutations sont beaucoup plus couramment présentes dans les séquences de pointe du BA.1 et des variantes apparentées par rapport à d'autres variantes, dont beaucoup affectent le domaine S2, qui médie la cellule -fusion cellulaire après liaison au récepteur par le domaine S1 (Fig. 1 supplémentaire). Des études antérieures ont suggéré que la variante BA.1 a une fusogénicité inférieure à la souche ancestrale (Wuhan) du SARS-CoV-210,13. Pour confirmer la fusogénicité de BA.1 et des lignées antérieures, y compris Wuhan, B.1.1.7, B.1.351 et B.1.617.2, nous avons effectué des tests de fusion cellule-cellule en utilisant le SmBit-LgBit (luciférase fractionnée) et le Systèmes GFP-RFP qui ont été précédemment développés dans notre laboratoire14. Nous avons également essayé d'exprimer de manière constitutive la protéine S en utilisant des lentivirus recombinants et en sélectionnant plus tôt des cellules transfectées par la construction exprimant S par un marqueur antibiotique, mais ces stratégies ont échoué. Cependant, étant donné que notre système de transfection transitoire précédemment développé assurait une efficacité de transfection élevée, nous avons décidé d'utiliser ce système pour le reste des expériences. Des constructions C-terminales tronquées (localisation plus efficace de la surface cellulaire) et S pleine longueur ont été testées dans ces systèmes. En bref, les cellules donneuses (cellules HeLa) expriment la protéine de fusion S-SmBit ou S-GFP et les cellules receveuses (293ACE2) expriment LgBit ou RFP. Comme les cellules HeLa n'expriment pas l'ACE215, elles ne subissent pas d'autofusion. La microscopie confocale démontre une expression similaire des protéines de pointe dans les cellules HeLa du donneur (Fig. 2a supplémentaire). Après une fusion réussie entre les cellules donneuses et receveuses, les signaux luminescents peuvent être détectés en raison de l'interaction SmBit et LgBit et des signaux de fluorescence jaune de la colocalisation GFP et RFP. Comme prévu, nous avons observé que BA.1 présentait une fusogénicité significativement plus faible dans les systèmes SmBit-LgBit (Fig. 1a) et GFP-RFP (Fig. 1b, c). Les signaux de colocalisation GFP-RFP ont été quantifiés par ImageJ et illustrés à la Fig. 1b. Dans l'ensemble, les variants S tronqués C-terminaux ont montré une fusogénicité plus élevée que les variants S non tronqués, comme prévu (Fig. 3 supplémentaire).

un test de fusion cellule-cellule a été réalisé avec les variants S du SRAS-CoV-2 (voir Méthodes). Les différentes cellules donneuses transfectées S-SmBit tronquées (HeLa) et les cellules receveuses transfectées LgBit (293ACE2) ont été mélangées 24 h après la transfection et ont été incubées pendant 48 h. Après incubation, les signaux de luminescence ont été mesurés par un lecteur de plaque POLARstar Omega. Tous les points de données sont présentés sous forme de valeurs moyennes (écart-type (SD), n = 8 répétitions biologiques indépendantes). b, c De même, les différentes cellules donneuses transfectées par S-GFP (HeLa) et les cellules receveuses transfectées par RFP (293ACE2) ont été mélangées 24 h après la transfection et incubées pendant 48 h supplémentaires. Après incubation, les signaux de colocalisation entre GFP et RFP ont été mesurés à l'aide du microscope à fluorescence CellSens. Le plasmide exprimant GFP-SmBit a été transfecté dans des cellules donneuses (HeLa) pour le contrôle. Pour la quantification, 10 champs ont été sélectionnés au hasard pour mesurer l'activité de fusion (n = 10). Les signaux de colocalisation ont été quantifiés par ImageJ. À des fins de comparaison statistique, les valeurs P ajustées sont présentées (vs Wuhan, *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001 ; ns : non significatif). Tous les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Barre d'échelle 50 µm. d Les différentes cellules donneuses transfectées S-SmBit tronquées (HeLa) et les cellules receveuses transfectées LgBit (293ACE2) ont été mélangées 24 h après la transfection et ont été traitées avec cinq concentrations différentes (30 µg/mL, 10 µg/mL, 3 µg/ mL, 1 µg/mL, 0,3 µg/mL) d'anticorps anti-S. 48 h après le mélange, les signaux de luminescence ont été mesurés à l'aide d'un lecteur de plaque POLARstar Omega. Tous les points de données sont présentés sous forme de valeurs moyennes (SD, n = 4 répétitions biologiques indépendantes).

Un anticorps anti-S polyclonal neutralisant qui cible le domaine S2 a bloqué la fusion de tous les variants du SRAS-CoV-2 de la même manière (Fig. 1d). Les inhibiteurs de fusion précédemment décrits tels que le 25-hydroxycholestérol (25-HC), l'itraconazole et la dichlorcyclizine ont montré une inhibition dose-dépendante similaire de l'activité de fusion des variants du SRAS-CoV-2 (Fig. 4 supplémentaire)14,16. Nous avons également confirmé que les différentes activités fusogéniques des variants du SRAS-CoV-2 sont étayées par les niveaux d'expression totaux comparables de la protéine de pointe entre les variants par test Western blot (Fig. 4a) et les modèles de distribution cellulaire similaires entre les variants observés par microscopie confocale. (Fig. 2a supplémentaire). Nous avons ensuite testé la cytotoxicité potentielle due à l'expression de la protéine de pointe et n'avons observé aucune différence significative entre les variantes (Fig. 2b supplémentaire). De plus, nous avons mesuré l'infectivité des variantes à l'aide de pseudoparticules de virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) recouvertes de SARS-CoV-2 et avons constaté que B.1.1.7, B.1.351, B.1.617.2 et BA.1 présentaient une infectivité globale plus élevée que la souche ancestrale de Wuhan (Fig. 5 supplémentaire). L'infectivité du BA.1 infectieux semblait dépendre des lignées cellulaires testées10,17,18. Fait intéressant, même si la fusogénicité de BA.1 était nettement inférieure à celle de Wuhan, son infectiosité était comparable sinon supérieure à celle de Wuhan dans notre système. L'infectivité plus élevée de BA.1 est probablement due à des mutations dans la région S1, telles que le domaine de liaison au récepteur, qui confèrent une plus grande affinité à ACE210. L'effet combiné d'un engagement plus élevé des récepteurs et d'une fusogénicité plus faible peut encore entraîner une infectivité plus élevée.

Une étude précédente a montré que les cellules infectées par le SRAS-CoV-2 expriment la protéine de pointe à leur surface cellulaire et forment des syncytia avec les cellules ACE2-positives voisines19. Pour confirmer la formation syncytiale dans les cellules infectées par le SRAS-CoV-2 et pour tester la fusogénicité de diverses variantes du SRAS-CoV-2, nous avons effectué un test de fusion de virus vivants. Pour ce test, une lignée cellulaire Huh7.5 exprimant de manière stable ACE2 et TMPRSS2 (Huh7.5-A2T2) a été transfectée avec le plasmide GFP et sélectionnée par l'antibiotique G418. Ensuite, cette lignée cellulaire stable a été infectée par divers variants du SRAS-CoV-2. 24 heures après l'infection, une formation syncytiale a été détectée (Fig. 2a). La coloration du dilactate de 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, noyaux) emballée est représentée sous la forme d'un syncytium (blob GFP) et est agrandie dans chaque image en médaillon. Une fusogénicité plus élevée a été détectée dans les cellules infectées par les variantes B.1.1.7 et B.1.617.2 et une fusogénicité plus faible a été montrée pour la variante BA.1. La variante B.1.351 n'a pas démontré de différence significative par rapport à la souche Wuhan. Pour la quantification, 20 champs ont été sélectionnés au hasard et la fusogénicité a été quantifiée par le nombre de noyaux colorés au DAPI divisé par le nombre de gouttes de GFP (Fig. 2b). Pris ensemble, les variants du SRAS-CoV-2 ont montré un comportement fusogénique similaire à celui des résultats des tests de fusion cellule-cellule déclenchés par S rapportés sur les Fig. 1a, b.

a Des cellules Huh7.5-A2T2 exprimant la GFP ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits. 24 h après l'ensemencement, les cellules ont été infectées par des variants du SRAS-CoV-2 et incubées pendant 2 h. Les cellules ont été lavées après 2 h et incubées pendant 22 h supplémentaires, suivies d'une fixation au paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Après incubation, le DAPI a été utilisé pour la coloration des noyaux. Les signaux GFP et DAPI ont été évalués à l'aide du microscope à fluorescence CellSens. b Pour la quantification, 20 champs ont été sélectionnés au hasard pour mesurer l'activité de fusion (n = 20). La fusogénicité a été quantifiée par le nombre de noyaux DAPI divisé par le nombre de blobs GFP. Pour compter le nombre de gouttes de GFP, une goutte de GFP continue a été comptée une cellule fusionnée ou non fusionnée. Lorsqu'il y a une intensité de signal GFP discontinue ou un signal GFP en forme de goutte circulaire discontinue dans la goutte, ils ont été comptés séparément pour distinguer les cellules voisines non fusionnées des cellules fusionnées. Les nombres moyens de noyaux DAPI et de blobs GFP par emplacement sont suivis ; Wuhan (DAPI : 103.7, GFP : 19.4), B.1.1.7 (DAPI : 98.3, GFP : 12.0), B.1.351 (DAPI : 86.4, GFP : 14.3), B.1.617.2 (DAPI : 122.6, GFP : 11.0), BA.1 (DAPI : 68.6, GFP : 23.0), Mock (DAPI : 68.2, GFP : 29.0). À des fins de comparaison statistique, les valeurs P ajustées sont présentées (vs Wuhan, *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001 ; ns : non significatif). Tous les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. Barre d'échelle 50 µm.

Pour étudier les effets des mutations dans la variante BA.1, nous avons introduit des mutations individuelles ou combinées dans les séquences de pointe de Wuhan ou BA.1. Tout d'abord, nous avons introduit des mutations individuelles dans la séquence de pointe BA.1. Parmi plus de 30 mutations dans la variante BA.1 (Fig. 1 supplémentaire), nous avons décidé de poursuivre les 11 mutations C-terminales, qui affectent probablement l'activité de fusion en raison de leur proximité avec les sites de clivage S1/S2, S2' et HR1. région. Deux mutations parmi ces 11 mutations (D614G et P681H) ont déjà été caractérisées dans des études antérieures20,21,22. Nous avons donc étudié les 9 autres mutations. Ces 9 mutations ont été introduites dans la séquence de pointe BA.1 individuellement pour ramener chaque mutation à la séquence de Wuhan. Parmi eux, les mutations inverses au niveau des acides aminés 547 (K547T), 655 (Y655H), 856 (K856N), 954 (H954Q) et 969 (K969N) ont montré une fusogénicité plus élevée par rapport à la variante originale BA.1, suggérant que ces mutations sont responsable de la diminution de la fusogénicité du variant BA.1 (Fig. 3a). Fait intéressant, la mutation inverse au niveau de l'acide aminé 981 (F981L) présentait une fusogénicité inférieure à celle de la variante BA.1, ce qui suggère que cette mutation pourrait avoir émergé pour compenser d'autres mutations de diminution de la fonction dans la variante BA.1 (Fig. 3a ). Trois autres mutations K679N, K764N et Y796D n'ont montré aucune différence appréciable dans l'activité de fusion de la variante BA.1.

Le test de fusion cellule-cellule a été réalisé avec des mutants S associés à BA.1. Les différentes cellules donneuses transfectées S-SmBit tronquées (HeLa) et les cellules receveuses transfectées LgBit (293ACE2) ont été mélangées 24 h après la transfection et ont été incubées pendant 48 h. Après incubation, les signaux de luminescence ont été mesurés par un lecteur de plaque POLARstar Omega. a Des mutations individuelles ont été introduites dans la séquence BA.1 S. À l'exception des mutations correspondantes, le reste de la séquence est identique à la séquence BA.1 S native. De même, les mutations combinées ont également été introduites dans la séquence BA.1S. Tous les points de données sont présentés sous forme de valeurs moyennes (SD, n = 4-8 répétitions biologiques indépendantes). À des fins de comparaison statistique, les valeurs P ajustées sont présentées (vs BA.1, *P < 0,05 ; ****P < 0,0001 ; ns : non significatif). Tous les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. b Des mutations individuelles ont été introduites dans la séquence Wuhan S. À l'exception des mutations correspondantes, le reste de la séquence est identique à la séquence native Wuhan S. De même, les mutations combinées ont également été introduites dans la séquence Wuhan S. Tous les points de données sont présentés sous forme de valeurs moyennes (SD, n = 4-8 répétitions biologiques indépendantes). À des fins de comparaison statistique, les valeurs P ajustées sont présentées (vs Wuhan, **P < 0,01 ; ****P < 0,0001 ; ns : non significatif). Tous les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes. c Les activités fusogéniques de diverses constructions S de sous-variantes BA.1 ont été mesurées de manière similaire. Tous les points de données sont présentés sous forme de valeurs moyennes (SD, n = 8 répétitions biologiques indépendantes). À des fins de comparaison statistique, les valeurs P ajustées sont présentées (vs BA.1, **P < 0,01 ; ****P < 0,0001 ; ns : non significatif). Tous les résultats sont représentatifs de trois expériences indépendantes.

Ensuite, nous avons testé des mutations combinées avec un ensemble près du site de clivage S1/S2, et l'autre près du site de clivage S2' et dans la région HR1. K547T et Y655H ont été introduits ensemble dans une construction, et K856N, H954Q et K969N ont été combinés séparément dans une autre construction. Comme prévu, les mutants combinés ont montré une fusogénicité plus élevée par rapport aux mutants individuels. Lorsque les 5 mutations ont été combinées, la fusogénicité était encore plus élevée que la construction de pointe de Wuhan. Comme prévu, la fusogénicité a été réduite lorsque le F981L compensatoire putatif a été introduit dans les 5 mutations combinées (Fig. 3a). Fait intéressant, le mutant contenant K856N, H954Q et K969N a montré une fusogénicité plus élevée que celui contenant K547T et Y655H, suggérant que les mutations près du site de clivage S2 'et dans la région HR1 ont un effet plus fort sur la fusogénicité que les mutations près du S1/S2 site de clivage.

Pour vérifier les effets des 6 mutations ci-dessus, nous avons introduit des mutations BA.1 individuelles ou combinées dans la séquence de pointe de Wuhan. Puisqu'il s'agit de mutations inverses des mutations ci-dessus, nous nous attendions à ce qu'elles aient un schéma de fusogénicité opposé. En effet, les mutations au niveau des acides aminés 547 (T547K), 655 (H655Y), 856 (N856K) et 969 (N969K) ont montré des activités fusogènes inférieures à celles de la souche Wuhan, ce qui confirme que ces mutations sont responsables de la diminution du phénotype fusogène du BA. .1 variante. Comme prévu, la mutation au niveau de l'acide aminé 981 (L981F) a présenté une fusogénicité plus élevée que la souche Wuhan. La mutation au niveau de l'acide aminé 954 (Q954H) n'a pas montré de fusogénicité significativement réduite par rapport à la souche Wuhan (Fig. 3b). Il est possible que cette mutation nécessite la présence d'autres mutations pour produire son effet lorsqu'elle est introduite dans la souche Wuhan. Encore une fois, les mutations combinées ont démontré une fusogénicité significativement plus faible que la souche Wuhan dans un schéma qui est cohérent avec les analyses mutationnelles précédentes dans la variante BA.1.

Pour examiner plus en détail la fusogénicité d'autres sous-variantes BA.1, y compris BA.2, BA.2.12.1 et BA.4/5, nous avons généré les séquences de pointe de la sous-variante BA.1 illustrées dans la Fig. 1 supplémentaire. Parce que BA.4 et BA.5 partage la même séquence de pointes, nous l'appelons BA.4/5. Dans le test de fusion cellule-cellule, BA.4/5 a montré une fusogénicité légèrement accrue et BA.2 et BA.2.12.1 n'ont montré aucune différence significative par rapport à la variante BA.1 (Fig. 3c).

Pris ensemble, nous avons identifié 5 mutations individuelles responsables de la diminution du phénotype fusogène du variant BA.1 et une mutation compensatoire associée à une fusogénicité accrue. En outre, des mutations dans ou autour du site de clivage S2' et HR1 peuvent avoir un effet plus fort sur la fusogénicité par rapport aux mutations à proximité du site de clivage S1/S2. Enfin, toutes les sous-variantes BA.1 sauf BA. 4/5 ont une fusogénicité comparable.

Le clivage accru du site S1/S2 a été associé à une infectiosité, une fusogénicité et une pathogénicité accrues des variants du SRAS-CoV-223,24. Ici, nous visons à déterminer si les mutations BA.1 identifiées ci-dessus peuvent entraîner une réduction du clivage S1/S2 expliquant la diminution de la fusogénicité. Nous avons testé le clivage S1/S2 des variants du SRAS-CoV-2 et de divers mutants de pointe associés à BA.1. Nous avons transfecté ces plasmides exprimant des pointes dans Huh7.5-A2T2 et analysé les niveaux de pointe pleine longueur et S2 (Fig. 4). Les niveaux de protéine de pointe étaient comparables parmi les variantes Wuhan, B.1.1.7, B.1.351 et B.1.617.2. Le niveau de protéine de pointe BA.1 est apparu légèrement inférieur à celui des autres variantes (Fig. 4a). B.1.1.7 et B.1.617.2 ont montré des niveaux S2 plus élevés, tandis que BA.1 a montré un niveau S2 inférieur à Wuhan (Fig. 4a). Cette différence de clivage S1/S2 est similaire au modèle observé dans le test de fusion cellule-cellule dans la plupart des variantes à l'exception de la mutation Q954H, BA.2, BA.2.12.1 et BA.4/5 qui sont toutes les sous-variantes de BA.1 présentaient des niveaux de S2 similaires à ceux de BA.1 et bien inférieurs à celui de Wuhan (Fig. 6a supplémentaire). Les tests de mutations BA.1 individuelles ont montré un clivage S1 / S2 réduit de manière variable, ce qui est reproductible dans deux autres lignées cellulaires (Fig. 4b et Fig. 6b-c supplémentaires).

Les cellules Huh7.5-A2T2 ont été transfectées avec des vecteurs exprimant des variants S du SRAS-CoV-2 (a) ou des vecteurs exprimant des mutants S associés à BA.1 (b). 24 h après la transfection, les cellules ont été collectées avec du tampon de lyse et d'extraction RIPA et un cocktail d'inhibiteurs de protéase. Les échantillons lysés ont été traités ultérieurement pour mesurer le niveau de S/S2 avec un système de transfert Western automatisé (Simple Western™ Automated Western Blot System). Ensuite, ImageJ a été utilisé pour quantifier l'intensité relative du signal. Les intensités de signal relatives normalisées pour la β-actine ont été tracées séparément en tant que rapport S (complet), S2 et S2/S (complet). Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes.

Étant donné que les trois mutations, Q954H, N969K et L981F, résident dans la région HR1, elles peuvent affecter le processus de fusion virale. Nous avons donc réalisé une étude structurale plus détaillée d'une de ces mutations HR1. Auparavant, nous avons montré que la région HR1 (résidus N919-Q965) adopte une conformation hélicoïdale liée à la membrane en présence de mimétiques bicouches (bicelles) qui représentent probablement un état intermédiaire lié aux lipides du processus de fusion de la membrane virale25. Dans cet état lié aux lipides, la structure α-hélicoïdale adoptée par les HR1 amphipathiques échantillonne au moins deux conformations qui sont en échange rapide l'une avec l'autre : un ensemble de conformères adopte une hélice a droite régulière, et l'autre contient un coude à la position d'acide aminé Q954 (Fig. 5b). Étant donné que Q954H correspond à l'une des variantes de BA.1, nous avons recherché tout changement structurel associé à cette mutation, à la fois dans l'état lié aux lipides et dans l'état post-fusion du faisceau à six hélices (6HB). Nous avons précédemment mesuré les taux d'échange d'hydrogène (HX) du squelette amide pour la séquence de type sauvage (WT) à l'état lié aux lipides avec une grande précision. Les protons d'amide du squelette s'échangent avec le solvant lorsqu'ils ne sont pas engagés dans des liaisons hydrogène intra- ou intermoléculaires stables26, c'est-à-dire que ce taux d'échange indique la fraction de temps pendant laquelle les liaisons H sont transitoirement interrompues. Pour la plupart des HR1, les taux de HX pour le mutant Q954H sont très similaires à ceux des résidus WT HR1 correspondants, suggérant des propriétés dynamiques similaires du mutant et du WT (Fig. 5c). Étant donné que les taux de HX sont sensibles au type de résidu et à son voisin immédiatement précédent, les taux de HX pour le WT et le mutant peuvent différer au site de mutation. Pour supprimer cette dépendance au type de résidu, les taux de HX ont été convertis en facteurs de protection, ce qui supprime la dépendance au type de résidu. Encore une fois, pour la majeure partie de la chaîne polypeptidique de HR1, les facteurs de protection se sont avérés très similaires pour les mutants WT et Q954H (Fig. 5d). Cependant, une diminution d'environ trois fois des facteurs de protection est observée pour le mutant Q954H au niveau de la région N953-N955, suggérant que le mutant favorise la formation de la conformation coudée. Une diminution beaucoup plus faible, d'environ 15 %, de la protection HX s'étend du résidu A944 au résidu K964. Étant donné que les conformations hélicoïdales droites et coudées sont liées aux lipides, la mesure HX, associée à de très petites différences de déplacements chimiques par rapport à WT (Fig. 7 supplémentaire), indique que la mutation Q954H ne modifie pas de manière significative la propension à se lier aux lipides de HR1. L'augmentation des changements de déplacement chimique pour la région C-terminale (L959-V969) semble être liée au déplacement de la population vers le conformère coudé pour la variante Q954H.

a La séquence primaire d'acides aminés de HR1 (résidus N919-Q965) et HR2 (résidus G1171-E1207) en gras. Dans la construction Core, une courte séquence de liaison flexible (SGLVPRGSG) relie les répétitions hélicoïdales HR1 et HR2. Le site de mutation, Glu-954 est indiqué en rouge. b Représentations en ruban pour les deux conformations liées aux lipides (droites et coudées) de HR1 qui sont en équilibre et échangent rapidement l'une avec l'autre. La mutation Q954H augmente la population de la conformation coudée. c Taux HX spécifiques aux résidus et (d) les facteurs de protection correspondants de HR1WT (bleu) et HR1Q954H (rouge), normalisés à pH 7. Un facteur de protection de 1 (ligne pointillée) correspond à aucune protection contre l'échange d'hydrogène, c'est-à-dire population importante de liaisons hydrogène intramoléculaires. Les données ont été obtenues sur 100 uM de [15N/2H]-HR1Q954H en présence de 100 mM de dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC)/dihexanoyl phosphatidylcholine (DHPC) (q ~ 0,5). Les données pour HR1WT sont reproduites à partir de travaux antérieurs25. e Superposition des spectres CD Far-UV de 10 µM Core en l'absence (CoreWT-noir et CoreQ954H-olive) en présence de 4 M d'urée (CoreWT-bleu et CoreQ954H-rouge). f Fusion thermique de CoreWT (bleu) et CoreQ954H (rouge) telle qu'observée par CD en présence d'urée 4 M. Les températures de fusion du CoreWT et du CoreQ954H sont respectivement de 88 °C et 90 °C.

Conformément à une étude cryo-EM rapportée précédemment28, nous avons constaté qu'en solution, la structure du 6HB, état post-fusion, formé par la construction Core (HR1 et HR2 reliées par un court lieur flexible) n'est pas significativement affectée par la mutation Q954H29 . Les spectres CD UV lointains du WT et du Q954H de l'état 6HB affichent la même signature α-hélicoïdale caractéristique avec deux minima à 208 nm et 222 nm (Fig. 5e). Pour exclure toute différence de stabilité thermodynamique entre le mutant WT et Q954H, les courbes de fusion thermique ont été surveillées à 222 nm. Comme les températures de fusion réelles étaient bien supérieures à 100 ° C, des expériences ont été menées en présence d'un dénaturant pour obtenir une comparaison quantitative des deux constructions. Fait intéressant, même en présence de concentrations assez élevées de dénaturant, 4 M d'urée, la structure secondaire du 6HB apparaît largement non perturbée à la fois pour le WT et le mutant (Fig. 5e). Des températures de fusion de 88 et 90 ° C ont été mesurées pour le WT et le Q954H, ce qui ne suggère aucune différence significative dans la stabilité des états 6HB post-fusion entre les deux constructions (Fig. 5f).

Un article récent a signalé l'exigence d'un pH acide pour que le SRAS-CoV-2 infecte avec succès les cellules30. Par conséquent, nous avons recherché si H954, qui peut modifier son état de protonation au cours de l'acidification, est engagé dans des interactions stabilisatrices de 6HB dépendantes du pH impliquant sa fraction imidazole (Fig. 8 supplémentaire). Une telle interaction entraînerait une déviation de sa valeur de pKa par rapport à 6,5, ce qui s'applique en l'absence d'interactions stabilisatrices de structure31. La valeur déterminée expérimentalement pour H954, pKa = 6,4, indique l'absence d'une telle interaction pour l'état 6HB dans la plage de pH pertinente pour la fusion membranaire.

Les structures de la protéine de pointe SARS-CoV-2 dans les états de préfusion et de postfusion ont été résolues par cryo-EM32. De plus, la structure 6HB de HR1 et HR2 à l'état post-fusion a été davantage caractérisée pour les variants28. Sur la base de ces structures, nous avons modélisé les 6 mutations décrites ci-dessus et évalué leurs effets potentiels sur la structure et la fonction de la protéine de pointe dans le contexte de la fusion virale (Fig. 6). Les emplacements de ces mutations sont indiqués sur la structure monomère de S (Fig. 6a). La mutation T547K se localise dans le sous-domaine 1/2 et forme un pont salin avec D389 (Fig. 6b). Cet effet peut altérer l'interaction S1/S2 et affecter le clivage S1/S2, comme les mutations D614G et P681H20,22,24. La mutation H655Y près du site de clivage S1/S2 peut former de multiples interactions avec d'autres acides aminés adjacents (Fig. 6c), ce qui confère probablement un clivage S1/S2 altéré. Il est également possible que cette mutation puisse affecter le clivage S2' ultérieur après l'engagement du récepteur. La mutation N856K dans le domaine S2 peut former un pont salin avec D568 de S1, affectant éventuellement l'interaction S1/S2 et réduisant le clivage S1/S2 (Fig. 6d). La mutation Q954H se localise dans le HR1. La glutamine de type sauvage, mais pas la mutation de l'histidine, peut former une liaison hydrogène avec R1014 (Fig. 6e), ce qui peut provoquer un changement conformationnel subtil du domaine S2 et entraîner un clivage S1/S2 moins efficace. La mutation N969K dans le HR1 pointe vers un solvant et ne crée aucune interaction avec d'autres acides aminés dans la structure du trimère de préfusion. Cependant, cette mutation peut encore diminuer le clivage S1/S2 (Fig. 4). Il est possible que cette mutation ait un effet subtil sur la conformation de S2 avec une efficacité de clivage S1/S2 plus faible. La mutation L981F dans la région distale de HR1 n'a aucun effet perceptible sur l'interaction intermoléculaire. Ainsi, nous n'avons pas une bonne explication de son effet sur le clivage S1/S2.

une représentation en ruban de la protéine monomère de pointe BA.1 dans la conformation proche. Le domaine S1 est représenté en bleu et le domaine S2 est représenté en gris. Les mutations sont représentées en boules et colorées en rouge, bleu et marron pour les atomes O, N et C, respectivement. b Mutation de T547K dans le WT et BA.1. Les protéines trimères sont représentées par des rubans en gris (S2) et cyan (S1). La liaison H formée entre K547 et D389 dans BA.1 est représentée en pointillé rouge. c Mutation de H655Y au site de clivage S1/S2 (G614). L'interaction d'empilement aromatique entre H655Y et F643 est montrée, alors qu'une liaison H supplémentaire est formée entre Y655 et T696 dans le BA.1. d Mutation de N856K observée dans la variante Wuhan et BA.1. K856 forme un pont de sel avec D568. e Mutation de Q954H dans le Wuhan et BA.1. Q954 mais pas H954 forme une liaison H avec R1014. f Mutations de Q954H, N969K et L981F dans le domaine HR1 (gris) et forment des interactions de liaison H avec des résidus du domaine HR2 (cyan) dans la structure post-fusion 6HB.

Enfin, les mutations Q954H, N969K et L981F résident dans le domaine HR1 qui, avec le HR2, forme le 6HB dans la structure post-fusion. Il est possible qu'ils affectent la stabilité du 6HB et donc la fusogénicité. Une étude récente a évalué la structure du faisceau post-fusion de pointe parmi les variantes du SRAS-CoV-2 et a montré une structure 6HB légèrement déplacée de la protéine contenant les trois mutations par rapport à celle de la protéine de type sauvage28. La mutation Q954H ne devrait pas perturber la structure 6HB car les deux acides aminés peuvent former une liaison hydrogène avec S1175 de HR2 d'un autre S2 (Fig. 6f). Nos données RMN ci-dessus n'ont pas non plus montré d'effet notable du Q954H sur la stabilité du 6HB. Même s'il peut sembler possible que dans les conditions de pH acide de l'endosome, le H954 puisse être protoné et affecter la structure du 6HB, nos données de RMN en solution n'ont montré aucune perturbation de son pKa. La mutation N969K perturberait probablement la structure 6HB en raison des chaînes latérales substantiellement différentes de l'asparagine et de la lysine. Dans la structure 6HB, la chaîne latérale de l'asparagine (type sauvage) peut former une paire de liaisons hydrogène avec le squelette oxygène et azote du G1167, qui peut former une seule liaison hydrogène avec la chaîne latérale protonée de la lysine (mutante) (Fig. 6f ). Étant donné que les mutations L981F et N969K ont des effets opposés sur l'activité de fusion, l'effet de L981F sur la structure 6HB contrecarre probablement celui de N969K, entraînant seulement un léger déplacement avec les deux mutations dans la structure résolue28. Dans la structure actuellement disponible du 6HB, la densité de la chaîne latérale L981F n'est pas bien résolue et donc difficile de dire avec certitude tout impact de la mutation28. Cependant, nous suggérons que le S1161 de HR2 peut former une liaison hydrogène avec l'oxygène du squelette de L981 mais pas avec F981 (Fig. 6f).

Depuis fin 2021, l'Omicron (BA.1) et ses sous-variantes ont émergé et se sont répandus dans le monde et sont devenus les variantes dominantes33,34,35. En raison de leur propagation rapide, les variants BA.1 étaient considérés comme plus infectieux et transmissibles. Cependant, les études in vitro, bien qu'encore controversées, n'ont pas montré d'infectivité accrue claire, comme les lignées antérieures. En fait, BA.1 semble être moins infectieux dans de nombreuses études13,36. La transmissibilité accrue de BA.1 peut être le résultat d'une affinité accrue de la protéine de pointe pour le récepteur ACE2 et/ou d'une sensibilité réduite aux anticorps préexistants dans la population37,38,39,40. En effet, de nombreuses mutations (>30) sont présentes dans la protéine de pointe et largement distribuées dans la protéine S1, y compris les domaines de liaison N-terminal et récepteur et la protéine S211,12,41. En revanche, BA.1 semble présenter une pathogénicité atténuée par rapport aux lignées antérieures37,38,39,40. Ici, nous avons montré que BA.1 a une fusogénicité significativement plus faible que toutes les lignées antérieures, y compris les variantes B.1.1.7, B.1.351, B.1.617.2. Nous avons estimé que la fusogénicité réduite contribue probablement à la faible pathogénicité de BA.1. Des études antérieures ont soutenu que la propriété fusogénique du SARS-CoV-2 est l'un des facteurs contribuant à la pathogenèse du SARS-CoV-242,43. Un rapport récent suggère que la fusion médiée par les pointes active la voie de la caspase-9, ce qui entraîne l'activation de la caspase-3/7 et de la pyroptose médiée par la gasdermine E43.

Dans cette étude, nous avons examiné les mutations associées à BA.1 dans la protéine de pointe qui pourraient être responsables de son phénotype fusogénique atténué. Nous avons estimé que les mutations de la protéine S1 sont probablement associées à une augmentation de la liaison à l'ACE2 et à la fuite des anticorps. Cependant, il est possible que des mutations de la protéine S1 affectent la fusogénicité. En effet, certaines des mutations de la protéine S1 seraient impliquées non seulement dans l'augmentation de la liaison à l'ACE2 et de l'échappement des anticorps, mais également dans la fusogénicité22,44,45,46. Bien que certaines des mutations de la protéine S1 puissent être impliquées dans la fusogénicité, nous avons décidé de nous concentrer sur 9 mutations situées dans le sous-domaine 1/2, autour du site de clivage S1/S2, ou dans la séquence S2 incluant HR1, car ces des mutations ont été couramment observées dans de nombreux sous-variants de BA.1. Nous avons estimé qu'en étudiant ces mutations, nous pourrions obtenir un aperçu mécaniste de la fusogénicité et de la pathogénicité de BA.1 et de ses sous-variants. D614G et P681H n'ont pas été étudiés car ces deux mutations ont déjà été bien caractérisées. La mutation D614G améliore l'infectiosité, tandis que la fusogénicité est comparable au niveau de la souche parentale Wuhan47,48. La mutation P681H contribuerait à l'augmentation de l'activité de fusion22.

Sur les neuf mutations, nous avons constaté que cinq (T547K, H655Y, N856K, Q954H et N969K) contribuent à la fusogénicité atténuée de BA.1. Fait intéressant, une mutation (L981F) a montré un effet fusogène opposé, ce qui réduit la fusogénicité globale des cinq mutations combinées. Cette mutation aurait pu apparaître pour compenser la fusogénicité très réduite d'autres mutations, de sorte que le virus serait toujours infectieux. Nous avons observé que les cinq mutations responsables de la fusogénicité atténuée présentaient une efficacité de clivage S1/S2 plus faible qui peut s'expliquer par la modélisation structurelle. Un article récent a montré que la mutation H655Y confère une activité fusogénique plus élevée et un clivage S1/S2 accru9, ce qui est différent de nos résultats. Dans cette étude, les auteurs ont testé une seule lignée cellulaire. Dans notre étude ici, nous avons testé dans plusieurs lignées cellulaires avec des expériences répétées. Ainsi, nous ne sommes pas sûrs de la différence.

Comme décrit ci-dessus, les mutations N856K, Q954H, N969K peuvent affecter la structure de la protéine S à l'état de préfusion, entraînant une réduction du clivage S1/S2. Sur la base des analyses RMN et CD, la mutation Q954H peut également exercer un autre effet, c'est-à-dire déplacer la distribution d'équilibre de l'ensemble structurel intermédiaire lié aux lipides de HR125, ce qui peut avoir un impact négatif sur la fusion virale. L'effet global de Q954H, N969K et L981F sur la fusion virale peut être plus compliqué. En plus de leur effet sur le clivage S1/S2, ils peuvent affecter le processus de fusion à l'étape requise de formation de la structure post-fusion 6HB. Nos résultats suggèrent collectivement que les effets de ces mutations sont compliqués et entrelacés. Certaines des mutations peuvent avoir un effet épistatique dans le contexte d'autres mutations.

Les activités fusogéniques des variants B.1.1.7, B.1.351 et B.1.617.2 sont proportionnelles à leurs infectivités élevées. BA.1 se comporte différemment par rapport aux lignées antérieures avec de nombreuses mutations émergeant dans les domaines S1 et S2. Les mutations dans le domaine S1 contribuent probablement à l'affinité accrue entre la pointe et l'ACE2, ce qui compenserait la fusogénicité atténuée conférée par les mutations dans le domaine S2. L'infectivité des autres sous-variants de BA.1 semble être inférieure à celle d'Omicron BA.1 sur la base de notre système de virus pseudotypé (Fig. 5 supplémentaire). La comparaison des séquences de ces variants de BA.1 (Fig. 1 supplémentaire) indique que BA.1 présente un schéma de mutation unique dans le domaine S1 par rapport aux autres sous-variants, ce qui peut expliquer l'infectivité plus élevée de BA.1.

Les variantes émergentes du SARS-CoV-2 semblaient être moins sensibles aux anticorps monoclonaux neutralisants approuvés ciblant le RBD du domaine S1 en partie à cause des mutations d'échappement dans cette région49. Les efforts récents dans le développement d'anticorps thérapeutiques contre le SRAS-CoV-2 se sont concentrés sur la structure en hélice de peptide/tige de fusion plus conservée du domaine S2, qui médie la fusion virale50,51. Il est tentant de supposer que des variantes d'Omicron avec de nombreuses mutations affectant le processus de fusion peuvent avoir émergé en réponse à des anticorps naturels contre S2 dans les populations infectées et être peut-être moins sensibles à cette classe alternative d'anticorps neutralisants.

Notre étude révèle une interaction intrigante et pourtant complexe de diverses mutations dans la protéine de pointe des variantes BA.1, qui sont devenues les variantes virales dominantes dans le monde. Ces variantes sont probablement apparues dans le cadre d'une immunité croissante et émergente contre le virus, induite soit par une vaccination basée sur la population, soit par une infection généralisée, parmi la population mondiale après deux ans et demi de pandémie. La pression évolutive a sélectionné de manière attendue des variantes moins sensibles à l'immunité existante, mais il est intéressant de noter également que des variantes, comme les Omicrons, sont moins virulentes. Le virus de la grippe est connu pour muter le site de clivage de la furine de son hémagglutinine afin de modifier le tropisme viral et la pathogénicité52. Il est intéressant de supposer que des variantes moins virulentes du SRAS-CoV-2 pourraient être plus transmissibles au niveau de la population car les personnes infectées sont moins symptomatiques et conscientes de leur infection, et donc plus facilement transmises aux autres, en particulier face à une infection moins sévère. -précautions de contrôle au cours de la dernière année. Le SRAS-CoV-2 pourrait continuer à évoluer et devenir un virus encore moins virulent, comme le virus du rhume, qui va muter, s'adapter et se propager dans la population. Il est intéressant de supposer qu'un virus hautement pathogène, une fois introduit dans une population hôte sensible, peut co-évoluer avec l'hôte pour établir une implantation plus permanente dans l'univers microbien de l'hôte.

Des cellules HeLa, Vero E6 et CaCo-2 (HeLa, CCL-2 ; Vero E6, CRL-1586 ; CaCo-2, HTB-37 ; ATCC, Manassas, VA, USA) ont été cultivées dans EMEM (ATCC, Manassas, VA , USA) et des cellules HEK293T (CRL-3216, ATCC, Manassas, VA, USA) ont été maintenues dans du DMEM (Corning, Corning, NY, USA). 293ACE2 (cellules exprimant ACE2)53 et Huh7.5-A2T2 (cellules exprimant ACE2 et TMPRSS2, fournies par Charles Rice)54 cellules ont été cultivées dans du DMEM (Corning) avec 1 µg/mL de puromycine pour 293ACE2 et 250 µg/mL de G418 pour Huh7.5-A2T2. Les cellules Vero E6-T2 (cellules exprimant TMPRSS2, fournies par l'installation centrale SARS-CoV-2 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of Health) ont été maintenues dans l'EMEM (ATCC) avec 200 µg/mL d'hygromycine B Tous les milieux ont été additionnés de 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) à l'exception de CaCo-2 (sérum bovin fœtal 20 % inactivé par la chaleur) et les cellules ont été maintenues dans un 37 ° C et 5 Incubateur % CO2.

Les composés chimiques ont été achetés auprès de sources commerciales : 25-HC (MilliporeSigma), itraconazole (MilliporeSigma). Des anticorps contre la protéine S du SARS-CoV-2 ont été achetés auprès de diverses sources commerciales (anti-S1, Cat# : GTX135356, GeneTex, Irvine, CA, USA et anti-S2, Cat# : PA5-116917, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, Cat# : GTX632604, GeneTex) et utilisé pour divers tests virologiques. Des anticorps anti-β-actine (Cat # : ab8227, Abcam, Cambridge, UK), anti-VSV (Cat # : REA005, Imanis Life Sciences, Rochester, MN, USA) ont également été obtenus dans le commerce.

Le plasmide d'ADNc SARS-CoV-2 S (Genscript, Piscataway NJ, USA) a été acheté auprès d'une source commerciale. Le C-terminal de la séquence S du SARS-CoV-2 (contenant un signal de rétention ER) a été tronqué de 20 acides aminés pour augmenter le rendement viral15,55. Afin d'introduire un codon d'arrêt pour la troncature, une seule mutation de nucléotide a été réalisée au niveau du nucléotide 3759 (C à A) en utilisant le kit de clonage In-Fusion (Takara, Shiga, Japon) conformément aux instructions du fabricant. La séquence S tronquée a été utilisée pour remplacer la séquence VSV-G dans le plasmide pCMV-VSV-G (numéro de plasmide Addgene : 8454)56 après digestion avec BamHI. Les mutations dans la séquence S des variants B.1.1.74, B.1.35157, B.1.617.258 et tous les mutants S individuels ont été introduits à l'aide du kit de mutagénèse dirigée Q5 (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA) sauf pour BA.111,12,41 qui a été synthétisé par une source commerciale (Genscript). Les plasmides assemblés ont été utilisés pour la génération de virus pseudotypés VSV. Des constructions S pleine longueur (non tronquées) ont été générées de manière similaire. Les sites de mutation pour B.1.1.7, B.1.351, B.1.617.2, BA.1 et ses sous-variants (BA.2, BA.2.12.1, BA4, BA.5 et BQ.1)35 ,41 sont illustrés dans la Fig. 1 supplémentaire.

Pour les essais de fusion cellule-cellule, des séquences supplémentaires ont été ajoutées aux constructions SARS-CoV-2 S ci-dessus pour générer à la fois du S-SmBit tronqué et du S-GFP tronqué. Le squelette pCMV-VSV-G digéré par BamHI a également été utilisé pour les deux constructions. Pour la construction S-SmBit tronquée, la séquence S tronquée et la séquence P2A-SmBit ont été amplifiées par PCR et combinées avec le squelette digéré à l'aide du kit de clonage In-Fusion conformément aux instructions du fabricant. Pour la génération de la construction S-GFP tronquée, les séquences S et P2A tronquées de la construction ci-dessus et de la GFP ont été amplifiées par PCR et combinées comme ci-dessus. Les constructions exprimant RFP et LgBit ont été produites de manière similaire en utilisant le kit de clonage In-Fusion comme les constructions ci-dessus.

Pour mesurer la fusion cellule-cellule médiée par la protéine SARS-CoV-2 S, des cellules HeLa (donneur) ont été transfectées avec S fusionné avec le plasmide exprimant GFP ou S tronqué fusionné avec le plasmide 14 exprimant SmBit. SmBit provient du système NanoBit (Promega, Madison, WI, USA) et se couple avec LgBit pour émettre un signal de luminescence. Les cellules 293ACE2 (destinataires) ont été transfectées avec un plasmide exprimant RFP ou LgBit. Le réactif de transfection FuGENE® 6 (Promega) a été utilisé pour la transfection selon les instructions du fabricant. La colocalisation entre GFP et RFP permet la visualisation des événements de fusion et l'interaction entre les protéines SmBit et LgBit dans les cellules fusionnées fournit une enzyme fonctionnelle qui émet des signaux luminescents. Ce système SmBit-LgBit est adapté à la quantification des événements de fusion14. Comme contrôle négatif, une construction GFP-SmBit a été utilisée à la place de S-SmBit. En bref, les cellules donneuses et les cellules receveuses ont été transfectées avec les plasmides appropriés mentionnés ci-dessus. 24 h après la transfection, les cellules du donneur et du receveur ont été détachées par 5 mM EDTA et Accutase, respectivement. Pour chaque puits d'une plaque de 96 puits, 30 000 cellules donneuses et 15 000 cellules receveuses ont été ensemencées. Des plaques noires à fond transparent (Corning) ont été utilisées pour la mesure de la fluorescence et des plaques blanches (Greiner Bio-One, Kremsmunster, Autriche) ont été utilisées pour la mesure de la luminescence. Ensuite, les deux cellules ont été co-cultivées avec des composés inhibiteurs dans du DMEM contenant 10 % de FBS pendant 48 h. Pour l'analyse de colocalisation GFP-RFP, 15 à 20 champs ont été choisis au hasard parmi 4 répétitions pour mesurer les cellules fusionnées sous un microscope à fluorescence CellSens (Olympus, Tokyo, Japon). Pour quantifier les signaux de colocalisation, ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) a été utilisé. Pour l'évaluation SmBit-LgBit, des substrats de nanoluciférase (Furimazine) ont été ajoutés et les signaux de luminescence ont été mesurés par un lecteur de plaque POLARstar Omega (BMG LABTECH, Ortenberg, Allemagne) immédiatement après l'ajout des substrats. Le signal de fond du contrôle GFP-SmBit a été soustrait de tous les échantillons expérimentaux.

Les stocks viraux ont été générés, maintenus et manipulés sur la base des SOP formulées par les National Institutes of Health dans un laboratoire de niveau de biosécurité désigné approprié. Les variantes du SARS-CoV-2 utilisées dans cette étude ont été fournies par l'installation centrale SARS-CoV-2 de l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses, des National Institutes of Health et des ressources BEI (beiresources.org). Les références des variantes sont les suivantes : SVG-001/USA-WA1 (Wuhan) ; SVG-015 R.-U./CA B.1.1.7 ; SVG-019 RSA 1.351 501Y ; SVG-028 B.1.617.2 ; SVG −053 BA.1 SARS‐CoV‐ 2/human/U SA/HI‐CDC‐4359259‐001/2021. Toutes les variantes ci-dessus ont été générées dans Vero E6-T2, qui exprime TMPRSS2.

Pour les tests de fusion de virus vivants, Huh7.5-A2T2 exprimant la GFP, qui a été transduite par un vecteur lentiviral, a été ensemencé dans des plaques à 96 puits à une densité de 40 000 cellules par puits. Après 24 h, les cellules ont été infectées par différents variants du SRAS-CoV-2 et ont été incubées à 37 °C pendant 2 h. 2 h après l'infection, les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). 24 h après l'infection, les cellules ont été fixées dans du PFA à 4 % (ChemCruz, Dallas, TX, USA) pour des expériences en aval.

Un VSV recombinant pseudotypé avec sa propre glycoprotéine VSV-G en trans a été fourni par Adolfo Garcia-Sastre (Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, USA)59. La séquence de la protéine G native a été remplacée par la luciférase Firefly, ce qui a donné le virus recombinant défectif pour la réplication. Pour produire un pseudovirus, la glycoprotéine G native délétée a été complétée par un plasmide exprimant VSV-G.

Pour générer divers virus pseudotypés, des cellules HEK293T ont été ensemencées à une densité de 4 millions de cellules par boîte de 10 cm et transfectées avec 10 µg de variants S du SRAS-CoV-2 exprimant des plasmides. Le réactif de transfection FuGENE® 6 (Promega) a été utilisé pour la transfection selon les instructions du fabricant. 24h post-transfection, les cellules ont été infectées par les virus pseudotypés VSV-G et le milieu a été lavé et remplacé par du milieu frais 4h après post-infection. Les virus pseudotypés SARS-CoV-2 variants S ont été collectés 24 h après l'infection. Le milieu contenant le virus a été filtré à travers un filtre seringue de 0,22 µm et a été stocké à -80 °C.

Pour le test d'infectiosité du virus pseudotypé, les cellules cibles ont été ensemencées dans des plaques blanches à 96 puits à une densité de 15 000 cellules par puits. Avant l'infection, les niveaux d'ARNm du VSV L ont été mesurés pour calculer le nombre de copies du génome par volume de stock de VSV pseudotypé. Ensuite, les cellules ont été inoculées avec les mêmes nombres de copies du génome. 24 h après l'ensemencement, les cellules ont été infectées avec la même quantité de virus pseudotypés. 24 h après l'infection, les cellules ont été lysées dans du tampon de lyse rapporteur Promega (Promega) pendant 30 minutes, suivies de cycles de congélation-décongélation à -80 ° C. Le kit Amplite™ Luciferase Reporter Gene Assay (AAT Bioquest, Sunnyvale, CA, USA) a été utilisé pour mesurer l'activité de la luciférase conformément aux instructions du fabricant. Les signaux de luminescence ont été mesurés par un lecteur de plaque POLARstar Omega (BMG LABTECH).

Pour l'extraction des protéines, le tampon de lyse et d'extraction RIPA (Thermo Fisher Scientific) et le cocktail d'inhibiteurs de protéase (Roche, Bâle, Suisse) ont été mélangés et utilisés pour la lyse d'échantillons cellulaires pendant 10 minutes à température ambiante. Les échantillons lysés ont été centrifugés pendant 10 min à 12 000 tr/min à 4 °C et les surnageants ont été isolés. Les surnageants ont été utilisés pour la quantification des protéines par le kit d'analyse de protéines Pierce™ BCA (Thermo Fisher Scientific). Pour quantifier la protéine cible, un transfert Western automatisé a été effectué sur un système Western Blot automatisé Simple Western ™ (Bio-Techne, Minneapolis, MN, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant. Toutes les données d'image non recadrées sont présentées dans la Fig. 9 supplémentaire.

Des inserts de gènes pour la variante Q954H du SARS-CoV-2 Core (HR1 + HR2) et HR1 (Fig. 5a) ont été synthétisés et clonés dans le vecteur pJ414 (ATUM) comme décrit précédemment25. WT et les mutants ont été cultivés dans Escherichia coli BL21 (DE3) à 37 ° C et induits pour l'expression à une densité optique (600 nm) de 0, 8 avec une concentration finale de 2 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside pendant 4 heures. HR1 WT et son variant Q954H ont été purifiés en utilisant l'affinité de l'acide Ni-nitriloacétique (Ni-NTA) et des techniques de chromatographie liquide à haute pression en phase inverse, qui incluent également une élimination de l'étiquette His6 N-terminale par la protéase TEV, comme décrit précédemment 25 . Core WT et son variant Q954H ont été purifiés dans des conditions dénaturantes par chromatographie d'affinité Ni-NTA et repliés sur une colonne de chromatographie d'exclusion stérique (Superdex-200) dans un tampon non dénaturant (tampon phosphate de sodium 20 mM (pH 6), tampon phosphate 150 mM chlorure de sodium et 5 mM d'imidazole)25. Les constructions de base ont conservé une étiquette His6 à l'extrémité N-terminale.

Les spectres CD UV lointains ont été acquis sur un spectropolarimètre JASCO J-810 en utilisant une cuvette de longueur de trajet optique de 0, 1 cm dans un tampon phosphate de sodium 20 mM (pH 6), contenant du chlorure de sodium 30 mM. Pour les échantillons de Core, qui ne se sont pas dénaturés à des températures inférieures à 100 °C, la stabilité a été sondée après l'ajout d'urée 4 M. Les mesures ont été effectuées sur des échantillons de protéines de 10 μM. Les courbes de fusion du CD ont été surveillées à 222 nm sur la plage de température de 25 à 95 ° C acquise avec une vitesse de rampe de 1 ° C par minute.

Les taux de HX ont été obtenus pour deux échantillons contenant 0,1 mM de [15N/2H]-HR1WT ou [15N/2H]-HR1Q954H dans un tampon phosphate de sodium 20 mM (à pH 6,5 et pH 7) contenant 30 mM de chlorure de sodium et 1 mM d'imidazole plus 33 mM DMPC et 67 mM DHPC, un mélange lipidique qui forme des micelles mixtes en forme de disque communément appelées bicelles60,61. Les taux de HX ont été mesurés à l'aide de l'expérience WEX-III TROSY62 en utilisant un délai de recyclage (d1) de 5 s et sept durées de l'intervalle d'inversion de l'eau, allant de 5 à 1000 ms. Les mesures ont été effectuées à 30 °C sur un spectromètre 800 MHz. Les taux HX intrinsèques des bobines aléatoires ont été obtenus à partir du serveur Web SPHERE27. Les valeurs de pH des échantillons ont été dérivées des déplacements chimiques de l'imidazole 1H63.

Le pKa de H954 a été déterminé à partir d'une série de spectres 1H-15N TROSY-HSQC pour un échantillon contenant 0,15 mM de [15N/2H]-CoreQ954H dans un tampon de phosphate de sodium 20 mM et 30 mM de NaCl, par des changements progressifs du pH de l'échantillon sur la plage de 5,0 à 7,6. Le pKa a été extrait des déplacements chimiques 1H et 15N en utilisant l'équation63 :

où δobs est le déplacement chimique RMN observé du pic d'intérêt, δHA et δA sont les déplacements chimiques de la forme protonée et déprotonée.

Les cellules HeLa ont été transfectées avec des plasmides S de variants SARS-CoV-2 et ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % (ChemCruz) 48 h après la transfection. Après fixation, les cellules ont ensuite été perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,5% dans du PBS et ont été bloquées par de l'albumine de sérum bovin à 3% (BSA, MilliporeSigma) dans du PBS. Les anti-S2 (Cat # : GTX632604, GeneTex) ont été dilués dans 0,1 % de Triton X-100 et 1 % de BSA contenant du PBS. L'IgG anti-souris d'âne Alexa Fluor 555 (Thermo Fisher Scientific) a été ajoutée aux cellules en tant qu'anticorps secondaire. Le DAPI (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour la coloration des noyaux. Les images ont été prises par un microscope confocal Zeiss LSM 700 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Allemagne).

Le kit de dosage luminométrique PhosphoWorks™ ATP (AAT Bioquest) a été utilisé pour mesurer la viabilité des cellules cibles qui ont été transfectées avec divers plasmides S de variants SARS-CoV-2. Les cellules HeLa ont été transfectées avec des plasmides S des variants SARS-CoV-2 et ont été transférées dans des plaques blanches à 96 puits à une densité de 10 000 cellules par puits 24 h après la transfection. Après 24 h supplémentaires, les activités de la luciférase ont été évaluées sur un lecteur de plaques POLARstar Omega (BMG LABTECH).

Les structures de la protéine de pointe SARS-CoV-2 de Wuhan et BA.1 ont été résolues par cryo-EM et extraites de la Protein Data Bank avec l'ID PDB 7DZW (Wuhan), 7WK2 (BA.1, S-close) et 7WVN (BA.1, S-ouvert). Avant l'analyse de modélisation, les structures des protéines de Wuhan et des variantes trimères ont été affinées et superposées à l'aide du programme MOE. De plus, la structure 6HB de HR1 et HR2 à l'état post-fusion a également été caractérisée28. Le Wuhan (7RZV) et le BA.1 (7TIK) ont été obtenus du PDB et utilisés pour des études structurelles. Pour définir diverses interactions intermoléculaires telles que la liaison hydrogène, le pont salin, etc., le logiciel Discovery Studio Visualizer a été utilisé.

Les données ont été analysées avec le logiciel GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis) et ont été présentées sous forme de moyenne (ET) de plus de trois répétitions expérimentales. Les valeurs P bilatérales, ajustées pour une comparaison multiple ANOVA unidirectionnelle, le cas échéant, ont été utilisées dans les analyses et les valeurs P < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. La taille de l'échantillon utilisé pour dériver chaque résultat statistique a été indiquée dans les légendes des figures appropriées.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données sources numériques pour les graphiques se trouvent dans les données supplémentaires. Les données à l'appui de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

Cele, S. et al. Omicron échappe largement mais incomplètement à la neutralisation Pfizer BNT162b2. Nature 602, 654–656 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Organisation Mondiale de la Santé. Suivi des variantes du SARS-CoV-2. https://www.who.int/activities/tracking-SARS-CoV-2-variants (2022).

Guo, H. et al. Structures des complexes de pointe Omicron et implications pour la neutralisation du développement d'anticorps. Cell Rep. 39, 110770 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meng, B. et al. Émergence récurrente de la délétion du pic SARS-CoV-2 H69/V70 et son rôle dans la variante Alpha B.1.1.7. Cell Rep. 35, 109292 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mlcochova, P. et al. SARS-CoV-2 B.1.617.2 Réplication du variant delta et évasion immunitaire. Nature 599, 114-119 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Akatsuki, S., Takashi, I., Rigel, S. et Tadashi, M. Fusogenèse et pathogénicité accrues de la mutation SARS-CoV-2 Delta P681R. Nature 602, 300–306 (2022).

Article Google Scholar

Dejnirattisai, W. et al. Réduction de la neutralisation du variant SARS-CoV-2 omicron B.1.1.529 par le sérum post-immunisation. Lancette 399, 234-236 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wolter, N. et al. Évaluation précoce de la gravité clinique du variant omicron du SRAS-CoV-2 en Afrique du Sud : une étude de couplage de données. Lancette 399, 437–446 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Escalera, A. et al. Les mutations dans les variantes préoccupantes du SRAS-CoV-2 sont liées à une augmentation du clivage des pointes et de la transmission du virus. Microbe hôte cellulaire 30, 373–387.e7 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meng, B. et al. L'utilisation modifiée de TMPRSS2 par le SARS-CoV-2 Omicron a un impact sur l'infectiosité et la fusogénicité. Nature 603, 706–714 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Planas, D. et al. Échappement considérable du SARS-CoV-2 Omicron à la neutralisation des anticorps. Nature 602, 671–675 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cao, Y. et al. Omicron échappe à la majorité des anticorps neutralisants SARS-CoV-2 existants. Nature 602, 657–663 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Suzuki, R. et al. Fusogenèse et pathogénicité atténuées du variant Omicron du SRAS-CoV-2. Nature 603, 700–705 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, SB et al. Cibler le processus de fusion de l'infection par le SRAS-CoV-2 par des inhibiteurs de petites molécules. MBio 13, e0323821 (2022).

Article PubMed Google Scholar

Cas, JB et al. Anticorps neutralisant et inhibition de l'ACE2 soluble d'un VSV-SARS-CoV-2 compétent pour la réplication et d'un isolat clinique de SARS-CoV-2. Microbe hôte cellulaire 28, 475–485.e5 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zang, R. et al. Le cholestérol 25-hydroxylase supprime la réplication du SRAS-CoV-2 en bloquant la fusion membranaire. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 117, 32105–32113 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lamers, MM, Mykytyn, AZ, Breugem, TI, Groen, N. & Knoops, K. SARS-CoV-2 Omicron infecte efficacement les voies respiratoires humaines, mais pas l'épithélium alvéolaire. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.01.19.476898 (2022).

Chiu, MC et al. Un modèle organoïde bipotentiel d'épithélium respiratoire récapitule l'infectiosité élevée de la variante SARS-CoV-2 Omicron. Cellule découverte. 8, 1–15 (2022).

Article Google Scholar

Buchrieser, J. et al. Formation de syncytia par des cellules infectées par le SRAS-CoV-2. EMBO J. 39, 1–12 (2020).

Article Google Scholar

Saito, A. et al. Renforcement de la fusogénicité et de la pathogénicité de la mutation SARS-CoV-2 Delta P681R. Nature 602, 300–306 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Du, X. et al. Omicron adopte une stratégie différente de Delta et d'autres variantes pour s'adapter à l'hôte. Transduct de signal. Cible. Là. 7, 5–7 (2022).

Google Scholar

Rajah, MM et al. Les variantes alpha, bêta et delta du SRAS‐CoV‐2 affichent une formation améliorée de syncytia médiée par Spike. EMBO J. 40, 1–17 (2021).

Article Google Scholar

Wrobel, AG et al. Les structures de la glycoprotéine de pointe SARS-CoV-2 et chauve-souris RaTG13 informent sur l'évolution du virus et les effets de clivage de la furine. Nat. Structure. Mol. Biol. 27, 763–767 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheng, YW et al. La substitution D614g de la protéine de pointe sars-cov-2 augmente la formation de syncytium et le titre viral via un clivage amélioré de la pointe médiée par la furine. MBio 12, e0058721 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Chiliveri, SC, Louis, JM, Ghirlando, R. & Bax, A. Les états transitoires liés aux lipides des répétitions heptades de la protéine de pointe donnent un aperçu de la fusion membranaire du SRAS-CoV-2. Sci. Adv. 7, 1–14 (2021).

Article Google Scholar

Englander, SW, Downer, NW & Teitelbaum, H. Échange d'hydrogène. Annu. Rév. Biochem. 903–924. https://doi.org/10.1038/nsb0901-741 (1972).

Bai, Y., Milne, JS, Mayne, L. & Englander, SW Effets de la structure primaire sur l'échange d'hydrogène du groupe peptidique. Structure des protéines. Fonct. Bioinforma. 17, 75–86 (1993).

Article CAS Google Scholar

Yang, K. et al. Conservation structurelle parmi les variantes du paquet de postfusion de la pointe SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 119, 1–9 (2022).

Google Scholar

Sun, H. et al. Base structurelle du noyau de fusion HCoV-19 et un peptide d'inhibition efficace contre l'entrée du virus. Urgence Les microbes infectent. 9, 1238-1241 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kreutzberger, AJB et al. Le SRAS-CoV-2 nécessite un pH acide pour infecter les cellules. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 119, 1–12 (2022).

Article Google Scholar

Grimsley, GR, Scholtz, JM & Pace, CN Un résumé des valeurs de pK mesurées des groupes ionisables dans les protéines repliées. Protéine Sci. 18, 247-251 (2009).

CAS PubMed Google Scholar

Cai, Y. et al. États conformationnels distincts de la protéine de pointe SARS-CoV-2. Sciences (80-.). 369, 1586-1592 (2020).

Article CAS Google Scholar

Shrestha, LB, Foster, C., Rawlinson, W., Tedla, N. & Bull, RA Évolution des variantes BA.1 à BA.5 de l'omicron du SRAS-CoV-2 : Implications pour l'évasion et la transmission immunitaires. Rév. Med. Virole. 32, e2381 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tian, D., Sun, Y., Xu, H. & Ye, Q. L'émergence et les caractéristiques épidémiques de la variante SARS-CoV-2 Omicron hautement mutée. J. Med. Virole. 94, 2376-2383 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qu, P. et al. Évasion distincte d'anticorps neutralisants des sous-variants d'Omicron du SRAS-1 CoV-2 BQ.1, BQ.1.1, BA.4.6, BF.7 et BA.2.75.2. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.19.512891 (2022).

Pastorio, C. et al. Déterminants de l'infectiosité, du traitement et de la neutralisation de Spike dans les sous-variants BA.1 et BA.2 du SARS-CoV-2 Omicron. Microbe hôte cellulaire 30, 1255–1268.e5 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shuai, H. et al. Réplication atténuée et pathogénicité du SRAS-CoV-2 B.1.1.529 Omicron. Nature 603, 693–699 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bálint, G., Vörös-Horváth, B. & Széchenyi, A. Omicron : augmentation de la transmissibilité et diminution de la pathogénicité. Transduct de signal. Cible. Là. 7, 2–4 (2022).

Google Scholar

Sun, K. et al. Transmission du SRAS-CoV-2, persistance de l'immunité et estimations de l'impact d'Omicron dans les cohortes de population sud-africaines. Sci. Trad. Méd. 14, eabo7081 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Syed, AM et al. Les mutations d'Omicron améliorent l'infectiosité et réduisent la neutralisation des anticorps des particules de type virus SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 119, 1–7 (2022).

Article Google Scholar

Cao, Y. et al. BA.2.12.1, BA.4 et BA.5 échappent aux anticorps provoqués par une infection par Omicron. Nature 608, 593–602 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rajah, MM, Bernier, A., Buchrieser, J. & Schwartz, O. Le mécanisme et les conséquences de la fusion médiée par les pointes du SRAS-CoV-2 et de la formation de syncytia. J. Mol. Biol. 434, 167280 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ma, H. et al. Pyroptose de syncytia formé par la fusion de la pointe SARS-CoV-2 et des cellules exprimant ACE2. Cellule découverte. 7, 7–10 (2021).

Article Google Scholar

Hoffmann, M., Zhang, L. & Pöhlmann, S. Omicron : Le maître de l'évasion immunitaire maintient une liaison ACE2 robuste. Transduct de signal. Cible. Là. 7, 2–4 (2022).

Google Scholar

Kimura, I. et al. La mutation SARS-CoV-2 spike S375F caractérise la variante Omicron BA.1. iScience 25, 105720 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, Y. et al. Amélioration à long terme de l'infectivité de la souris dotée de N501Y du SRAS-CoV-2 par les mutations non RBD d'Ins215KLRS et H655Y. Biol. Direct 17, 1–11 (2022).

Article Google Scholar

Korber, B. et al. Suivi des changements dans le pic de SARS-CoV-2 : Preuve que le D614G augmente l'infectiosité du virus COVID-19. Cellule 182, 812–827.e19 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ozono, S. et al. La mutation de la pointe SARS-CoV-2 D614G augmente l'efficacité d'entrée avec une affinité de liaison ACE2 améliorée. Nat. Commun. 12, 848 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Starr, TN et al. L'analyse mutationnelle profonde du domaine de liaison du récepteur SARS-CoV-2 révèle des contraintes sur le repliement et la liaison ACE2. Cellule 182, 1295–1310.e20 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dacon, C. et al. Des anticorps rares et convergents ciblant l'hélice de la tige neutralisent largement divers bêtacoronavirus. Microbe hôte cellulaire 1–15. https://doi.org/10.1016/j.chom.2022.10.010 (2022).

Dacon, C. et al. Les anticorps largement neutralisants ciblent le peptide de fusion du coronavirus. Sciences (80-.). 377, 728–735 (2022).

Article CAS Google Scholar

Sun, X., Tse, LV, Ferguson, AD & Whittaker, GR Les modifications du site de clivage de l'hémagglutinine contrôlent la virulence d'un virus de la grippe H1N1 neurotrope. J. Virol. 84, 8683–8690 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Q. et al. Le sulfate d'héparane aide le SRAS-CoV-2 à pénétrer dans les cellules et peut être ciblé par des médicaments approuvés in vitro. Cellule découverte. 6, 80 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ricardo-Lax, I. et al. Réplication et délivrance en un seul cycle des réplicons du SARS-CoV-2. Science. 374, 1099-1106 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiong, HL et al. Test de neutralisation robuste basé sur le pseudovirus du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) SARS-CoV-2 et les cellules BHK21 surexprimant ACE2. Urgence Les microbes infectent. 9, 2105-2113 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stewart, SA et al. Silençage génique stable délivré par le lentivirus par ARNi dans les cellules primaires. Rna 9, 493-501 (2003).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Villoutreix, BO, Calvez, V., Marcelin, AG et Khatib, AM Enquête in silico sur les nouvelles variantes britanniques (B.1.1.7) et sud-africaines (501y.v2) du SARS-CoV-2 avec un accent sur l'ace2 –interface rbd de pointe. Int. J. Mol. Sci. 22, 1–13 (2021).

Article Google Scholar

Planas, D. et al. Sensibilité réduite de la variante Delta du SRAS-CoV-2 à la neutralisation des anticorps. Nature 596, 276-280 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tscherne, DM & García-Sastre, A. Un test enzymatique pour la détection de l'entrée virale. Courant. Protocole Cell Biol. https://doi.org/10.1002/0471143030.cb2612s51 (2011).

Glover, KJ et al. Évaluation structurelle des bicelles phospholipidiques pour les études à l'état de solution des biomolécules associées à la membrane. Biophys. J. 81, 2163-2171 (2001).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prosser, RS, Evanics, F., Kitevski, JL & Al-Abdul-Wahid, MS Applications actuelles des bicelles dans les études RMN des amphiphiles et des protéines associées à la membrane. Biochimie 45, 8453–8465 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fitzkee, NC, Torchia, DA & Bax, A. Mesure de l'échange rapide d'hydrogène dans le domaine central catalytique homodimérique de l'intégrase du VIH-1 de 36 kDa (Protein Science (2011) 20, (500-512)). Protéine Sci. 20, 1643 (2011).

Article CAS PubMed Central Google Scholar

Baryshnikova, OK, Williams, TC & Sykes, BD Indicateurs de pH internes pour la RMN biomoléculaire. J. Biomol. RMN 41, 5–7 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Nous tenons à remercier Charles Rice (The Rockefeller University, New York, NY, USA) pour le partage des cellules Huh7.5-A2T2 et Adolfo Garcia-Sastre (Mount Sinai School of Medicine, New York, NY, USA) pour le partage d'un recombinant VSV pseudotypé avec la glycoprotéine VSV-G native. Nous tenons également à remercier l'installation centrale SARS-CoV-2 du National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, États-Unis. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros de l'Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales, le programme anti-COVID-19 ciblé intra-muros des NIH et les programmes intra-muros/extra-muros du National Center for Advancing Translational Sciences (National Institutes of Health , ETATS-UNIS).

Financement en libre accès fourni par les National Institutes of Health (NIH).

Direction des maladies du foie, Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK), National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, États-Unis

Seung Bum Park, Mohsin Khan, Parker Irvin, Madeleine Leek, Ailis Grieshaber, Zongyi Hu, Eun Sun Jang et T. Jake Liang

Laboratoire de physique chimique, Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK), National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, États-Unis

Sai Chaitanya Chiliveri et Ad Bax

Centre national pour l'avancement des sciences translationnelles (NCATS), Instituts nationaux de la santé, Rockville, MD, 20850, États-Unis

Xin Hu

Department of Internal Medicine, Seoul National University Bundang Hospital, Seoul National University College of Medicine, Seongnam, 13620, République de Corée

Eun Sun Jang

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Conceptualisation, SBP et TJL ; Enquête, SBP, MK, SCC, XH, PI, ML, AG, ZH, ESJ, AB ; Rédaction – Brouillon original, SBP ; Rédaction – révision et édition, TJL ; Acquisition de financement, TJL

Correspondance avec Seung Bum Park ou T. Jake Liang.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Zhijuan Qiu et David Favero.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons et indiquer si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Park, SB, Khan, M., Chiliveri, SC et al. Les variantes de SARS-CoV-2 omicron hébergent des mutations de protéines de pointe responsables de leur phénotype fusogénique atténué. Commun Biol 6, 556 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04923-x

Télécharger la citation

Reçu : 07 décembre 2022

Accepté : 08 mai 2023

Publié: 24 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04923-x

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.