L'immunisation contre la protéine d'arthropode altère la transmission de l'agent pathogène rickettsial des tiques à l'hôte vertébré

npj Vaccins volume 8, Numéro d'article : 79 (2023) Citer cet article

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L'anaplasmose humaine causée par Anaplasma phagocytophilum est l'une des maladies transmises par les tiques les plus courantes aux États-Unis. Les tiques à pattes noires, Ixodes scapularis, véhiculent et transmettent cette bactérie à l'homme. Dans cette étude, nous apportons la preuve que le ciblage d'anions organiques liés à la membrane I. scapularis transportant le polypeptide 4056 (IsOATP4056) avec un vaccin anti-vecteur affecte la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte vertébré. Anaplasma phagocytophilum induit l'expression d'IsOATP4056 dans les tiques et les cellules de tiques. Une localisation membranaire accrue d'IsOATP4056 était évidente dans les cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum. Le traitement avec une dose élevée (10 µg/ml) mais pas une faible dose (5 µg/ml) d'anticorps EL-6 qui cible la plus grande boucle extracellulaire d'IsOATP4056 a montré des effets cytotoxiques dans les cellules de tiques mais pas dans la lignée cellulaire de kératinocytes humains (HaCaT). L'immunisation passive, la transmission médiée par les tiques et les études in vitro réalisées avec des souris commandées auprès de deux fournisseurs commerciaux et avec des cellules de tiques ont montré que l'anticorps EL-6 altère non seulement la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte murin, mais contribue également à la réduction de la charges bactériennes dans les tiques engorgées et dans les cellules de tiques par activation de la voie de péage des arthropodes. De plus, une efficacité de mue réduite a été notée chez les tiques nourries avec des souris immunisées contre l'anticorps EL-6. Collectivement, ces résultats fournissent un bon candidat pour le développement d'un vaccin anti-tiques pour cibler la transmission d'A. phagocytophilum et peut-être d'autres agents pathogènes d'importance médicale transmis par les tiques.

Les maladies transmises par les tiques telles que la borréliose de Lyme, l'anaplasmose humaine, l'ehrlichiose, la fièvre pourprée des montagnes Rocheuses, la tularémie, l'encéphalite de Powassan, l'encéphalite transmise par les tiques, la maladie de la forêt de Kyasanur et d'autres sont des menaces importantes pour la santé humaine dans le monde entier1,2,3,4,5 . Les agents pathogènes à l'origine de ces maladies sont principalement transmis par les tiques via un repas de sang1,2,4,6,7. Des facteurs abiotiques et biotiques tels que le changement climatique et la disponibilité d'hôtes réservoirs et de tiques pourraient contribuer à l'expansion/répartition géographique des tiques et des maladies transmises par les tiques8,9,10. Les méthodes traditionnelles, telles que l'utilisation d'acaricides, pour contenir les infestations de tiques sont moins efficaces dans de nombreux cas11. Par conséquent, le développement de vaccins semble être une approche plus efficace et plus respectueuse de l'environnement pour prévenir ces maladies.

L'approbation du vaccin contre l'encéphalite à tiques (TICOVAC) prouve que les vaccins sont les stratégies idéales pour cibler/prévenir les maladies transmises par les tiques12. Cependant, il n'existe aucun vaccin autorisé pour traiter/prévenir plusieurs autres maladies bactériennes transmises par les tiques6,13,14. Une seule espèce de tique pourrait véhiculer et transmettre plusieurs agents pathogènes humains15,16,17. Par conséquent, des stratégies innovantes qui ciblent directement l'infestation par les tiques et la transmission d'agents pathogènes sont hautement souhaitables6,13,18. Plusieurs études ont mis en évidence que la vaccination contre les antigènes protecteurs des tiques empêcherait l'alimentation des tiques et/ou la transmission d'agents pathogènes6,13,18,19,20,21,22,23,24. Par conséquent, les études qui caractérisent les nouveaux antigènes protecteurs conservés sont importantes pour le développement d'un vaccin anti-tiques universel pour cibler plusieurs espèces de tiques. Un candidat vaccin anti-vecteur donne l'espoir de cibler plus d'un pathogène transmis par le même vecteur.

L'anaplasmose humaine causée par la bactérie intracellulaire obligatoire, Anaplasma phagocytophilum, est l'une des maladies à transmission vectorielle les plus courantes aux États-Unis25,26. Les manifestations cliniques incluent fièvre, malaise, céphalée, arthralgie, thrombocytopénie et leucopénie25. Cet agent est principalement transmis par une tique à pattes noires, Ixodes scapularis. Ces tiques ont quatre phases de développement qui comprennent les œufs, les larves, les nymphes et les stades adultes10. L'infection par A. phagocytophilum entraîne une série d'événements qui subvertissent la signalisation de l'hôte et aident la bactérie à persister chez les mammifères et les vecteurs arthropodes26,27,28,29,30,31,32,33,34. Une étude précédente de notre laboratoire a montré que I. scapularis Organic Anion Transporting Polypeptide (OATP) 4056 (IsOATP4056) était régulé positivement lors d'une infection par A. phagocytophilum35. De plus, l'ajout exogène du métabolite de la voie du tryptophane, l'acide xanthurénique (XA), aux tiques et aux cellules de tiques a entraîné une augmentation à la fois de l'expression d'isoatp4056 et de la charge bactérienne35. L'isoatp4056 est le seul OATP parmi neuf OATP chez les tiques qui a été régulé positivement dans les glandes salivaires lors d'une infection par A. phagocytophilum35. L'inactivation médiée par l'ARNi de l'isoatp4056 et l'inhibition des OATP avec un inhibiteur ont affecté la réplication bactérienne chez les tiques et les cellules de tiques35. Nous avons également noté que le virus Langat transmis par les tiques (LGTV) module les OATP chez les tiques et que l'inhibition de ces protéines affecte la charge virale dans les cellules des tiques36. Plus récemment, nous avons rapporté que XA peut aider l'agent pathogène à échapper aux espèces réactives de l'oxygène37. Dans l'étude de suivi, nous avons signalé qu'A. phagocytophilum régule à la baisse le microARN133 (miR-133) qui cible l'ARNm38 de l'isoatp4056. La surexpression de miR-133 chez les tiques a affecté la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte vertébré, ce qui suggère l'importance de l'IsOATP4056 dans cette transmission bactérienne38. Nous avons également noté que l'expression d'isoatp4056 était régulée positivement lors de la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte vertébré. Dans l'ensemble, ces études fournissent des preuves solides que le ciblage d'IsOATP4056 pourrait être une stratégie idéale pour bloquer la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte vertébré.

Les OATP sont des protéines de transport transmembranaire qui ont plusieurs boucles extracellulaires et intracellulaires39,40,41,42. Ces protéines contribuent au mouvement transcellulaire de diverses hormones, anions, molécules de signalisation, toxines et facteurs de croissance39,40,41,42,43. Sur la base de la prédiction bioinformatique, la partie C-terminale de l'IsOATP4056 s'étend hors de la membrane plasmique36, ce qui n'est pas observé dans d'autres OATP de tiques ou humains. Dans cette étude, nous avons utilisé deux anticorps polyclonaux purifiés par affinité dirigés contre la boucle extracellulaire-2 (EL-2) et la boucle extracellulaire C-terminale-6 (EL-6), pour mener des expériences in vitro et in vivo. Cette étude montre que la présence d'anticorps contre EL-6 d'IsOATP4056 réduit significativement la charge d'A. phagocytophilum à la fois dans les cellules de tiques et dans les tiques infectées nourries sur des souris immunisées. De plus, nous avons noté que l'immunisation passive avec l'anticorps EL-6 réduisait la transmission des bactéries des tiques à l'hôte murin. Nous montrons également que la présence d'anticorps EL-6 active la voie TOLL à la fois chez les tiques et les cellules de tiques et contribue à la réduction des charges bactériennes. Cette étude fournit des preuves de l'efficacité vaccinale d'un nouvel antigène protecteur de la tique pour cibler la transmission d'A. phagocytophilum et peut-être d'autres agents pathogènes des tiques à l'hôte vertébré.

Dans notre étude précédente, nous avons signalé que les transcrits d'isoapt4056 étaient significativement régulés à la hausse lors d'une infection à A. phagocytophilum chez les tiques35. Pour analyser si une observation similaire est évidente au niveau des protéines, des anticorps polyclonaux purifiés par affinité dirigés contre les peptides IsOATP4056 Extracellular Loop-2 (EL-2) et Extracellular Loop-6 (EL-6) ont été générés dans cette étude (Fig. 1a) . EL-6 est la plus grande région parmi les six boucles extracellulaires présentes dans IsOATP4056 (Fig. 1a). Le dosage immuno-enzymatique (ELISA) a montré une augmentation significative (P <0, 05) de la liaison accrue des anticorps EL-2 (Fig. 1b) et EL-6 (Fig. 1c) aux peptides IsOATP4056 respectifs par rapport à la liaison notée avec le contrôle peptide brouillé. De plus, les tests ELISA effectués avec des anticorps EL-2 (Fig. 1d) et EL-6 (Fig. 1e) et des lysats de tiques entières ou de cellules de tiques ont montré une expression significativement (P < 0,05) accrue d'IsOATP4056 chez les A. phagocytophilum non nourris infectés. les tiques nymphales (Fig. 1d et e) et les cellules de tiques (Fig. 1a et b supplémentaires) par rapport aux niveaux notés chez les témoins non infectés. De plus, des analyses d'immunotransfert avec des anticorps EL2 ou EL6 en présence (+) ou en l'absence (-) d'un mélange de déglycosylation ont révélé une bande intense au-dessus de 250 kDa dans les échantillons générés à partir de tiques entières infectées par A. phagocytophilum ou de lysats de cellules de tiques par rapport aux niveaux notés chez les témoins non infectés dans les deux conditions (Fig. 1f et g). Cependant, nous avons noté que lors de la déglycosylation suivie d'un immunotransfert avec l'anticorps EL2 mais pas avec l'anticorps EL6, des bandes intenses à ~ 250 kDa et ~ 100 kDA étaient également évidentes dans les échantillons générés à partir de cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum par rapport aux niveaux notés dans les cellules non infectées. contrôles (Fig. 1f et g). Une augmentation de deux à trois fois des niveaux de bande> 250 kDa (dans toutes les conditions) et des bandes ~ 250 kDa et ~ 100 kDa (en condition de déglycosylation suivie d'un sondage avec l'anticorps EL-2) était évidente dans les lysats préparés à partir d'A. phagocytophilum infecté cellules de tiques par rapport aux niveaux notés dans les lysats préparés à partir de témoins non infectés (Fig. 1f et g). De plus, l'analyse d'immunofluorescence effectuée avec l'anticorps EL-6 a montré une augmentation de la coloration IsOATP4056 dans les cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum par rapport à la coloration notée dans le contrôle non infecté (Fig. 2). De plus, il a été noté que des niveaux accrus d'IsOATP4056 étaient localisés sur la membrane plasmique des cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum par rapport aux niveaux notés sur les membranes plasmiques des témoins non infectés (Fig. 2). Collectivement, ces résultats montrent qu'A. phagocytophilum régule à la hausse l'IsOATP4056 dans les tiques et les cellules de tiques et améliore la localisation de cette protéine sur la membrane plasmique des cellules de tiques.

une représentation schématique de l'organisation IsOATP4056 sur la membrane plasmique des cellules de tique est montrée. Les boucles extracellulaires sont indiquées par des nombres de 1 à 6. Les extrémités N- et C-terminales sont marquées. Des anticorps ont été générés contre des épitopes de la région EL-2 ou EL-6. Les schémas ne sont pas dessinés à l'échelle. ELISA réalisé avec le peptide brouillé (b et c), le peptide EL-2 (b), le peptide EL-6 (c) sondé avec l'anticorps EL-2 ou EL-6 est montré. ELISA effectué avec des lysats de tiques entiers préparés à partir de tiques nymphales non infectées ou infectées par A. phagocytophilum sondées avec l'anticorps EL-2 (d) ou EL-6 (e) est montré. Chaque cercle/carré indique les données générées à partir d'un échantillon de tique ou de cellule de tique d'un puits de culture. La valeur p du test étudiant est indiquée. Les barres d'erreur indiquent +/- l'erreur standard par rapport à la moyenne. L'analyse par immunotransfert avec l'anticorps EL-2 (f) ou EL-6 (g) montrant les niveaux d'IsOATP4056 dans les tiques ou les cellules de tiques non infectées ou infectées par A. phagocytophilum en présence (+) ou en l'absence (-) du mélange de déglycosylation est montrée. La flèche indique la forme oligomère d'IsOATP4056 (> 250 kDa). ** indique la forme dimère d'IsOATP4056 (~ 250 kDa) et * indique la forme monomère d'IsOATp4056 (~ 100 kDa). M indique un marqueur, UI indique non infecté et j'indique des tiques ou des cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum.

Images microscopiques à contraste de phase ou fluorescentes montrant les niveaux d'IsOATP4056 en utilisant l'anticorps EL-6 (Alexa-594, rouge) et la coloration nucléaire (bleu, DAPI) dans des cellules de tiques non infectées ou infectées par A. phagocytophilum en utilisant l'anticorps EL-6. Les images fusionnées montrent la superposition d'IsOATP4056 avec la coloration DAPI. L'insertion dans les images fusionnées montre l'image éclatée de la cellule pointée par une flèche dans l'image complète. La barre d'échelle indique 100 µm.

Notre étude précédente a montré que l'inactivation médiée par l'ARNi de l'expression d'isoatp4056 entraînait une réduction de la charge bactérienne chez les tiques et les cellules de tiques35. Nous avons maintenant testé si le blocage de l'IsOATP4056 médié par les anticorps avait un effet similaire sur la charge bactérienne dans les cellules de tiques (Fig. 3 et Fig. 2 supplémentaire). Les cellules de tiques ont été traitées avec 5 µg / ml d'anticorps EL-2 (Fig. 2 supplémentaire) ou EL-6 (Fig. 3) un jour avant l'infection par A. phagocytophilum. La charge bactérienne a été surveillée 24 h après l'infection. L'analyse QRT-PCR a montré que la charge d'A. phagocytophilum était significativement réduite lors du traitement des cellules de tiques avec l'anticorps EL-6 par rapport à la charge notée dans les cellules de tiques traitées avec l'anticorps témoin (Fig. 3a). Cependant, aucune différence significative dans la charge bactérienne n'a été notée entre les cellules de tiques traitées par l'anticorps EL-2 et les cellules de tique traitées par l'anticorps témoin (Fig. 2 supplémentaire). Nous avons récemment montré qu'A. phagocytophilum module la régulation circadienne par l'horloge des gènes immunitaires innés des arthropodes lors de sa transmission par les tiques44. Nous avons donc déterminé si l'observation d'une charge bactérienne réduite lors du traitement par anticorps EL-6 était liée à l'activation des gènes immunitaires contre les tiques. L'analyse QRT-PCR a révélé que les gènes de la voie Toll des arthropodes, myd88 et pelle étaient significativement (P <0, 05) régulés à la hausse dans les cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum traitées avec des anticorps EL6 par rapport aux niveaux notés dans le groupe témoin traité avec des anticorps (Fig. .3g et h). Cependant, aucune différence significative dans l'expression des gènes jak (Fig. 3b), stat (Fig. 3c), pgrp (Fig. 3d), tak (Fig. 3e) et toll (Fig. 3f) n'était évidente entre EL-6 cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum traitées avec des anticorps et traitées avec des anticorps témoins. De plus, aucune différence significative ( P > 0, 05) dans l'expression des gènes immunitaires testés n'était évidente entre les cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum traitées avec un anticorps EL-2 ou traitées avec un anticorps témoin (Fig. 2b-h supplémentaire). Pour confirmer davantage si la voie Toll est essentielle pour la clairance bactérienne médiée par les anticorps EL6, nous avons réduit au silence l'expression de myd88 dans les cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum (Fig. 3i). L'inactivation médiée par l'ARNi de myd88 dans les cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum a entraîné une augmentation significative (P <0, 05) de la charge bactérienne (Fig. 3j). Cependant, le traitement des cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum contenant myd88-dsRNA avec l'anticorps EL-6 a entraîné une augmentation significative (P <0,05) de l'expression de myd88 (Fig. 3k) et une réduction de la charge bactérienne (Fig. 3l) par rapport aux niveaux noté dans les cellules traitées avec l'anticorps témoin. Pris ensemble, ces résultats indiquent que le traitement par anticorps EL-6 élimine efficacement l'infection par A. phagocytophilum dans les cellules de tiques grâce à l'activation de la voie immunitaire innée des arthropodes.

Analyse QRT-PCR montrant la charge bactérienne, analysée par les niveaux de p44 (a) et jak (b), stat (c), pgrp (d), tak1 (e), toll (f), myd88 (g) ou pelle (h ) expression dans des cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum témoins ou traitées à l'anticorps EL-6. Les anticorps témoins et EL-6 ont été utilisés à une concentration de 5 ug/ml. Analyse QRT-PCR montrant les niveaux d'expression de myd88 (i) ou la charge bactérienne (j) dans des cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum et traitées avec de l'ARNdb factice ou myd88. L'expression de myd88 (k) ou la charge bactérienne (l) dans des cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum et traitées avec des anticorps myd88-dsRNA témoins ou EL-6 est illustrée. Les niveaux d'Anaplasma phagocytophilum p44 ont été normalisés aux niveaux d'actine de la tique et les niveaux d'ARNm des gènes immunitaires innés de la tique ont été normalisés aux niveaux d'ARNr 5,8 S de la tique. La valeur p du test étudiant est indiquée. Les barres d'erreur indiquent +/- erreur standard de la moyenne. Chaque cercle représente les données obtenues à partir de l'échantillon prélevé dans un puits de la plaque de culture de cellules de tiques.

Pour analyser plus en détail si les anticorps EL-2 ou EL-6 ont des effets cytotoxiques, nous avons effectué un test basé sur des cellules vivantes / mortes comme décrit38 avec des cellules de tiques (Fig. 4) et avec une lignée cellulaire de kératinocytes humains (cellules HaCaT) (Fig. 5 ). Les cellules de tique (Fig. 4) ou HaCaT (Fig. 5) ont été traitées avec 10 µg / ml d'anticorps EL-2 ou EL-6 pendant 24 h et traitées pour la coloration Live / Dead et le test MTT. Une mortalité accrue a été observée dans les cellules de tiques traitées avec des anticorps EL-2 ou EL-6 par rapport à la mort cellulaire observée lors d'un traitement par anticorps témoin (Fig. 4a). La quantification à partir d'images microscopiques a montré un nombre important de cellules mortes dans les cellules de tiques traitées aux anticorps EL-6 et EL-2 par rapport au témoin (Fig. 4b). De plus, le test MTT a confirmé une réduction significative de la viabilité des cellules de tiques lors du traitement avec des anticorps EL-2 (Fig. 4c) ou EL-6 (Fig. 4d) par rapport à la viabilité observée dans les cellules traitées avec un anticorps témoin (Fig. 4). Cependant, le traitement des cellules HaCaT avec des anticorps EL-2 ou EL-6 n'a pas entraîné d'augmentation de la mort cellulaire par rapport à la mort cellulaire observée lors du traitement par anticorps témoin (Fig. 5a). La quantification à partir d'images microscopiques n'a montré aucune différence dans le nombre de cellules mortes entre les cellules de tiques traitées avec les anticorps EL-6 et EL-2 par rapport au témoin (Fig. 5b). Le test MTT a en outre confirmé que le traitement avec les anticorps EL-2 (Fig. 5c) ou EL-6 (Fig. 5d) n'entraînait pas la mort cellulaire dans les cellules HaCaT. Le traitement des cellules de tiques avec 5 µg/ml d'anticorps EL-2 ou EL-6 n'a pas entraîné de mort cellulaire considérable (Figs. 3 et 4 supplémentaires). Ces résultats montrent que les anticorps EL-2 et EL-6 ne sont cytotoxiques que pour les cellules de tiques mais pas pour les cellules humaines et que l'effet de ces anticorps sur la mort cellulaire était dépendant de la dose.

a Images microscopiques en contraste de phase ou fluorescentes montrant des cellules de tiques vivantes (vertes) ou mortes (rouges) non infectées. Les cellules de tiques non infectées ont été traitées avec des anticorps témoins ou EL-2 ou EL-6 à une concentration de 10 µg/ml. Après 24 h de post-traitement, les cellules ont été traitées pour un test de coloration Live/Dead, suivi d'une imagerie à l'aide d'un microscope à fluorescence. La barre d'échelle indique 200 μm. b La quantification des cellules mortes (rouge) à partir de 5 images est affichée. Test MTT montrant la viabilité des cellules de tiques après traitement avec des anticorps témoins (c et d) ou EL-2 (c) ou EL-6 (d) à une concentration de 10 µg/ml. L'axe Y indique la valeur d'absorbance obtenue en soustrayant l'absorbance mesurée à 690 nm de l'absorbance mesurée à 570 nm. Les barres d'erreur indiquent +/- erreur standard de la moyenne. La valeur p du test étudiant est indiquée.

a Images microscopiques en contraste de phase ou fluorescentes montrant des cellules HaCaT vivantes (vertes) ou mortes (rouges) non infectées. Les cellules HaCaT non infectées ont été traitées avec des anticorps témoins ou EL-2 ou EL-6 à une concentration de 10 ug/ml. Après 24 h après le traitement, les cellules ont été traitées pour un test de coloration Live/Dead, suivi d'une imagerie à l'aide d'un microscope à fluorescence. La barre d'échelle indique 200 μm. b La quantification des cellules mortes (rouge) à partir de 5 images est affichée. Test MTT montrant la viabilité des cellules HaCaT après traitement avec des anticorps témoins (c et d) ou EL-2 (c) ou EL-6 (d) à une concentration de 10 µg/ml. Les barres d'erreur indiquent +/- erreur standard de la moyenne. La valeur p du test étudiant est indiquée. L'axe Y indique la valeur d'absorbance obtenue en soustrayant l'absorbance mesurée à 690 nm de l'absorbance mesurée à 570 nm.

L'observation d'une charge bactérienne significativement réduite dans les cellules de tiques lors du traitement avec l'anticorps EL-6 (Fig. 3) nous a incités à rechercher si l'immunisation passive d'un hôte murin affecte la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte vertébré pendant l'alimentation sanguine. Des souris C3H d'âge et de fond appariés (C3H/HeNHsd et C3H/HeN) obtenues auprès de deux fournisseurs commerciaux différents (Envigo et Charles River Laboratories, respectivement) ont reçu une injection d'anticorps de contrôle ou d'anticorps EL-2 ou EL-6 à 15 µg/ souris (Fig. 6 et Fig. 5 supplémentaire). Après 24 h après l'immunisation, des nymphes à jeun infectées par A. phagocytophilum (10 tiques / souris) ont été nourries sur ces souris immunisées (Fig. 6a). La charge bactérienne a été analysée dans le sang murin et le tissu splénique le septième jour après le placement de la tique et dans les tiques repeuplées engorgées (Fig. 6 et Supplémentaire Fig. 5). L'analyse QRT-PCR a révélé que la charge d'A. phagocytophilum était significativement (P <0,05) réduite dans le sang des souris C3H/HeNHsd (Envigo) (Fig. 6b) et le tissu splénique (Fig. 6c) isolés de souris immunisées contre l'anticorps EL-6. par rapport à la charge bactérienne notée dans le sang murin (Fig. 6b) et le tissu splénique (Fig. 6c) isolés de souris immunisées contre les IgG témoins. Une observation similaire était évidente avec des études d'immunisation réalisées avec des souris C3H / HeN (Charles River Laboratories) immunisées avec l'anticorps EL-6 (Fig. 6d et e). Les études d'immunisation réalisées avec l'anticorps EL-2 n'ont montré aucune différence significative dans la charge bactérienne entre les souris C3H / HeNHsd immunisées par l'anticorps EL-2 ou les souris C3H / HeNHsd immunisées par l'anticorps IgG témoin (Fig. 5 supplémentaire). Ces résultats montrent que l'immunisation avec l'anticorps EL-6 réduit efficacement la transmission de A. phagocytophilum des tiques à l'hôte murin.

a Représentation schématique montrant le plan des études d'immunisation. Au jour 0, les souris ont été immunisées passivement avec des anticorps témoins, EL-2 ou EL-6 (15 ug/souris). Au jour 1, des tiques infectées par A. phagocytophilum ont été nourries sur des souris immunisées. Aux jours 4 à 7, des nymphes repues et engorgées ont été collectées. Au jour 8 après l'immunisation, toutes les souris ont été euthanasiées et des tissus de sang/rate ont été prélevés. Analyse QRT-PCR montrant la charge d'A. phagocytophilum dans le sang murin témoin ou EL-6 immunisé (b et d) ou le tissu splénique (c et e). Les immunisations ont été réalisées chez des souris provenant d'Envigo (b et c) ou de Charles River Laboratories (d et e). Les charges bactériennes ont été normalisées aux niveaux d'actine murine. Chaque cercle représente les données obtenues à partir d'un échantillon de souris. Les barres d'erreur indiquent +/- erreur standard de la moyenne. La valeur p du test étudiant est indiquée.

Pour déterminer l'effet de l'immunisation passive de l'hôte murin sur la charge d'A. phagocytophilum dans la tique elle-même, des échantillons de tiques repeuplées engorgées ont été traités pour PCR et ELISA (Fig. 7 et Fig. 6 supplémentaire). ELISA a montré que les nymphes infectées par A. phagocytophilum avaient ingéré des anticorps EL-6 (Fig. 7a) et EL-2 (Fig. 6a supplémentaire) dans son corps avec le repas de sang. L'analyse QRT-PCR a montré que la charge d'A. phagocytophilum était significativement (P <0, 05) réduite chez les tiques nourries avec des souris immunisées avec des anticorps EL-6 par rapport à la charge notée chez les tiques nourries avec des souris immunisées avec des anticorps témoins (Fig. 7b). Cependant, aucune différence significative dans la charge bactérienne n'était évidente entre les tiques nourries avec l'anticorps EL-2 et les souris immunisées contre l'anticorps témoin (Fig. 6b supplémentaire). Aucune différence significative dans l'expression de jak, stat, pgrp, tak1 et pelle n'était évidente chez les tiques nourries avec l'anticorps EL-6 ou les souris immunisées contre l'anticorps témoin (Fig. 7). Cependant, les transcrits de péage d'arthropodes étaient significativement régulés à la hausse chez les tiques nourries avec des souris immunisées contre l'anticorps EL-6 par rapport aux niveaux notés chez les tiques nourries avec des animaux témoins immunisés avec des anticorps (Fig. 7g). De plus, comme l'observation notée avec les cellules de tiques, les transcriptions de l'arthropode myd88 étaient significativement régulées à la hausse chez les tiques nourries avec des souris immunisées avec des anticorps EL-6 par rapport aux niveaux notés chez les tiques nourries avec des animaux témoins immunisés avec des anticorps (Fig. 7h). De plus, nous n'avons observé aucune différence significative dans l'expression de l'un des gènes immunitaires des arthropodes analysés chez les tiques nourries avec des souris immunisées contre l'anticorps EL-2 par rapport aux niveaux notés chez les tiques nourries avec des souris témoins immunisées avec des anticorps (Fig. 6 supplémentaire). ). Collectivement, ces résultats montrent que l'anticorps EL-6 entraîne la réduction des charges bactériennes dans une tique engorgée en raison de l'activation des voies immunitaires des arthropodes médiée par Myd88.

un test ELISA montrant la présence d'anticorps EL-6 dans le corps de la tique. Analyse QRT-PCR montrant la charge bactérienne (b) et l'expression de jak (c), stat (d), pgrp (e), tak (f), toll (g), myd88 (h) ou pelle (i) chez A. phagocytophilum - des tiques infectées nourries avec des souris témoins ou immunisées avec l'anticorps EL-6. Les souris ont été immunisées avec des anticorps témoins ou EL-6 à une concentration de 15 ug/souris. Les niveaux d'A. phagocytophilum p44 ont été normalisés aux niveaux d'actine de la tique et les niveaux d'ARNm des gènes immunitaires innés de la tique ont été normalisés aux niveaux d'ARNr 5,8 S de la tique. La valeur p du test étudiant est indiquée. Les barres d'erreur indiquent +/- erreur standard de la moyenne. Chaque cercle représente les données obtenues à partir de l'échantillon généré à partir d'une tique.

L'observation de la mort des cellules de tiques lors d'un traitement avec des anticorps EL-2 ou EL-6 nous a incités à rechercher si ces anticorps affectent la mue des tiques. Des C3H / HeNHsd (Envigo) appariés selon l'âge et le fond ont reçu une injection d'anticorps de contrôle ou d'anticorps EL-2 ou EL-6 à 30 µg / souris (Fig. 8a). Après 24 h post-immunisation, des nymphes naïves à jeun (15 tiques/souris) ont été nourries sur ces souris immunisées (Fig. 8a). Les tiques engorgées repeuplées ont été collectées à partir des jours 3 à 5 après le placement des tiques. Un total de 25, 22 et 11 nymphes nourries ont été prélevées sur des souris immunisées avec des anticorps témoins, EL-2 ou EL-6, respectivement. Ces tiques nymphales nourries ont été logées dans une chambre environnementale pour la mue (Fig. 8a). Les tiques nymphales nourries ont commencé à muer jusqu'au stade adulte après 30 jours d'incubation. Nous avons noté que 92 % des tiques nymphales nourries avec des souris immunisées contre des anticorps témoins ont mué en adultes (Fig. 8b). Alors que 81% ou 63% des tiques nymphales nourries de souris immunisées contre EL-2 ou EL-6, respectivement, ont mué en adultes (Fig. 8b). Collectivement, ces résultats montrent que le traitement avec l'anticorps EL-6 provoque non seulement la mort des cellules de tiques in vitro, mais affecte également la mue des tiques.

a Représentation schématique montrant le plan des études d'immunisation. Au jour 0, les souris ont été immunisées passivement avec des anticorps témoins, EL-2 ou EL-6 (30 ug/souris). Au jour 1, des tiques non infectées ont été nourries sur des souris immunisées. Aux jours 4 à 7, des nymphes repues et engorgées ont été collectées. Au jour 8 post-immunisation, toutes les souris ont été euthanasiées. Les nymphes engorgées ont été incubées dans une chambre environnementale pour permettre aux tiques de muer. b Histogramme montrant le pourcentage d'efficacité de mue des tiques nourries sur des souris témoins ou immunisées contre les anticorps EL-2 ou EL-6. Le nombre de tiques muées par rapport au nombre total analysé dans cette étude est indiqué en haut de chaque barre.

Le développement d'un vaccin anti-tiques ciblant les antigènes protecteurs des arthropodes est une approche innovante dans le domaine de la vaccinologie6,18,22,23,45. Il propose de cibler plus d'un pathogène transmis par la même tique6,18,22,23,45. Les stratégies vaccinales anti-vectorielles sont conçues pour bloquer l'acquisition d'agents pathogènes par les tiques ou la colonisation par les tiques, ou la transmission d'agents pathogènes par les tiques6,18,22,23,45. Plusieurs études ont testé ou proposé de générer des vaccins ciblant les protéines sécrétées par les tiques, cytosoliques ou membranaires6,18,21,22,23,45. Dans cette étude, nous apportons la preuve que le ciblage de la tique IsOATP4056, une protéine de transport membranaire, affecte la transmission de A. phagocytophilum du vecteur arthropode à l'hôte vertébré.

Les résultats des analyses ELISA, immunotransfert et immunofluorescence qui montrent des niveaux accrus d'IsOATP4056 dans les tiques et les cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum par rapport aux niveaux notés chez les témoins non infectés sont conformes aux données d'expression génique précédemment publiées par notre laboratoire35,37,38 ,46. Sur la base de la séquence primaire d'acides aminés, le poids moléculaire attendu de la protéine est d'environ 100 kDa. IsOATP4056 possède plusieurs résidus de modification post-traductionnelle, y compris des sites de glycosylation36. L'immunotransfert avec les anticorps EL-2 et EL-6 en l'absence de mélange de déglycosylation a montré une bande intense à> 250 kDa dans tous les échantillons de tiques et de cellules de tiques infectées par A. phaghocytophilum. La présence d'une bande intense accrue (détectée avec l'anticorps EL2) dans un échantillon de cellules de tiques infectées> 250 kDa même après déglycosylation indique que IsOATP4056 pourrait être présent sous une forme oligomérisée ou sous une autre forme modifiée post-traductionnelle. La détection de la bande ~ 250 kDa indique la dimérisation de l'IsOATp4056 et la bande à ~ 100 kDa indique la forme monomérique. EL-2 et EL-6 sont des boucles extracellulaires différentes de la protéine IsOATP4056. La déglycosylation n'a pas eu d'impact sur la liaison de l'anticorps EL-6 à la forme oligomérisée ou à une autre forme modifiée post-traductionnelle d'IsOATP4056 (bande> 250 kDa). Nous pensons que l'affinité de liaison pour les anticorps EL-2 et EL-6 sur IsOATP4056 pourrait être différente. Où, l'anticorps EL-6 pourrait facilement reconnaître l'épitope sous la forme oligomère d'IsOATP4056 et l'anticorps EL-2 pourrait reconnaître davantage la forme oligomère/autre modification post-traductionnelle, mais pourrait également reconnaître la forme déglycosylée/dimère/monomère d'IsOATP4056. L'observation de multiples formes d'IsOATP4056 de la tique est cohérente avec l'observation des OATP de mammifères qui forment des dimères/homo ou des hétéro-oligomères47,48. De plus, l'observation de bandes multiples dans des analyses d'immunotransfert avec l'anticorps EL-2 suggère que IsOATP4056 pourrait également être protéolytiquement clivé.

Dans une étude récente, nous avons signalé un contrôle circadien des gènes immunitaires des voies Toll et JAK/STAT tels que pelle et jak, respectivement, qui sont essentiels à la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte vertébré44. Dans cette étude, nous avons noté que l'activation de la voie Toll, en particulier Myd88, est essentielle pour la réduction bactérienne des tiques et des cellules de tiques en présence d'anticorps EL-6. Lorsque l'anticorps EL-2 ou EL-6 a été utilisé pour le traitement des tiques ou des cellules de tiques, seul le traitement par anticorps EL-6 a entraîné l'activation de la voie Toll/Myd88 qui a peut-être conduit à la réduction des charges bactériennes. L'observation d'une charge bactérienne significativement accrue dans les cellules de tiques traitées par myd88-dsRNA, suivie de la réduction des bactéries dans ces cellules lors du traitement par l'anticorps EL-6, a confirmé en outre l'activation médiée par EL-6 de la voie Toll dans la clairance bactérienne. IsOATP4056 a six boucles, où l'anticorps EL-2 se lie à l'épitope sur la deuxième boucle et l'anticorps EL-6 se lie à l'épitope sur la sixième boucle. Nous pensons que la liaison de l'anticorps EL-6 sur la sixième boucle pourrait avoir entraîné la perturbation de la signalisation qui a finalement abouti à l'activation de la voie Toll chez les tiques. Cependant, le mécanisme détaillé de l'activation de la voie Toll suite à la liaison de l'anticorps EL-6 sur IsOATP4056 doit être élucidé. Dans ce contexte, il est intéressant de noter qu'une étude précédente a rapporté une régulation négative de l'OATP-4 de souris de manière dépendante du TLR-4 lors d'un traitement avec LPS49.

L'observation de la mort cellulaire dans les cellules de tique et non dans les cellules HaCaT lors d'un traitement avec 10 µg/ml d'anticorps EL-2 ou EL-6 suggère que ces anticorps sont spécifiques de la tique IsOATP4056. Cependant, cette observation dépendait de la dose d'anticorps car aucune mort cellulaire n'a été notée dans les cellules de tiques lors du traitement avec 5 µg/ml. Les OATP participent au transport de plusieurs molécules39,40,41,42,43. Par conséquent, il n'est pas surprenant d'émettre l'hypothèse que le blocage des boucles extracellulaires d'IsOATP4056 pourrait affecter le transport de diverses molécules, y compris des nutriments qui pourraient éventuellement conduire à la mort cellulaire. De plus, l'observation d'une mue réduite chez les tiques nourries avec des souris immunisées contre l'anticorps EL-6 confirme en outre que l'IsOATP4056 est essentiel à la survie des cellules de la tique.

Les tiques ingèrent les protéines de l'hôte dans un repas de sang lorsqu'elles se nourrissent d'un hôte vertébré50. Par conséquent, il est raisonnable de supposer que les tiques pourraient également ingérer des anticorps lorsqu'elles se nourrissent de souris immunisées contre les anticorps EL-6 ou EL-2. Nos données ELISA montrent clairement que les tiques ingèrent les anticorps EL-6 et EL-2 lors d'un repas de sang. La réduction des charges bactériennes chez les tiques nourries avec des souris immunisées EL-6 indique que le ciblage d'IsOATP4056 pourrait également être envisagé comme une approche thérapeutique idéale pour altérer la transmission transstadiale d'A. phagocytophilum d'un stade de développement de la tique à l'autre.

L'observation de charges bactériennes réduites dans le sang et les tissus de la rate chez des souris (obtenues auprès de deux fournisseurs commerciaux différents) immunisées avec l'anticorps EL-6 mais pas avec l'anticorps EL-2 montre clairement que le blocage de l'arthropode IsOATP4056 au niveau de la région EL-6 altère la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte murin vertébré. Plusieurs scénarios peuvent être envisagés où la région EL-6 pourrait jouer un rôle important dans la fonction IsOATP4056 chez les tiques. Premièrement, EL-6 pourrait faciliter la sortie bactérienne des cellules et le blocage de cette région pourrait affecter la transmission d'A. phagocytophilum. Deuxièmement, la région EL-6 pourrait réprimer la signalisation de la voie Toll et le blocage de cette région sur IsOATP4056 pourrait activer la voie TOLL et entraîner une réduction des charges bactériennes. Troisièmement, la région EL-6 pourrait être impliquée dans le transport XA. XA est critique pour la colonisation par A. phagocytophilum dans les tiques et les cellules de tiques35,37. Par conséquent, le blocage de la région EL-6 pourrait affecter la survie et la sortie d'A. phagocytophilum des cellules de tiques. Avec une ou toutes ces hypothèses, le blocage d'IsOATP4056 dans la région EL-6 semble être une approche efficace pour entraver la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte vertébral.

En résumé, cette étude fournit des preuves que le ciblage du transporteur membranaire des arthropodes IsOATP4056 affecte la transmission d'A. phagocytophilum des tiques à l'hôte vertébré. Des études comme celles-ci sont non seulement importantes pour comprendre le rôle des molécules de tiques dans les interactions vecteur-pathogène, mais nous conduisent également au développement d'un vaccin anti-vecteur pour cibler la transmission d'A. phagocytophilum et peut-être d'autres agents pathogènes du vecteur de tique médicalement important au hôte vertébré.

La souche NCH-1 d'Anaplasma phagocytophilum a été utilisée tout au long de cette étude. Cette souche a été obtenue auprès de BEI Resources, NIAID, NIH. Anaplasma phagocytophilum a été maintenu dans la lignée cellulaire promyélocytaire humaine (cellules HL-60) comme décrit dans nos études précédentes35,38,44. La lignée cellulaire HL-60 a été obtenue auprès de l'ATCC, USA. Les larves d'Ixodes scapularis ont été obtenues auprès de BEI Resources, NIAID, NIH. Des études de transmission ont été réalisées avec des nymphes infectées par A. phagocytophilum et muées. La lignée cellulaire de tiques, ISE6, obtenue auprès de l'ATCC, USA, a été utilisée tout au long de cette étude. La lignée cellulaire de tiques a été maintenue comme décrit dans nos études précédentes35,38,44. L'élevage des tiques a été réalisé dans une chambre environnementale de Parameter Generation and Control, USA. L'incubateur a été réglé à 23 ± 2 ° C avec une humidité relative de 94% et des conditions de lumière: obscurité de 14:10.

Les anticorps polyclonaux IsOATP4056 utilisés dans cette étude ont été générés dans une installation commerciale (GenScript, USA). Les peptides correspondant aux régions IsOATP4056 des boucles extracellulaires 2 (NVTRIEDENTCQMP) et 6 avec 3' cystéine (TWRHKRELKEAPPLC) ont été utilisés pour générer des anticorps EL-2 et EL-6, respectivement. Les anticorps ont été filtrés stérilement et n'avaient pas de conservateurs. Dès réception des anticorps, les anticorps témoins EL-2 ou EL-6 ont été solubilisés dans l'eau et utilisés pour des expériences sur des animaux. Le volume pour 15 ou 30 ug/souris de solutions d'anticorps EL-2 ou EL-6 ou IgG témoin a été ajusté avec du chlorure de sodium à 0,9 % à un volume d'injection de 100 ul.

C3H/HeN (souris femelles, âgées de 4 à 6 semaines, CharlesRiver Laboratories, États-Unis) et C3H/HeNHsd (souris femelles, âgées de 4 à 6 semaines, Envigo) ont été utilisées dans cette étude. Des souris B6.129S7-Rag1tm1Mom/J (Jackson Laboratories, États-Unis) ont été utilisées pour maintenir l'infection par A. phagocytophilum. Les larves de tiques ont été nourries sur des souris non infectées ou infectées par A. phagocytophilum et muées en nymphes. Des nymphes infectées par A. phagocytophilum non nourries ont été nourries sur des souris témoins, immunisées contre les anticorps EL2 ou EL6. En bref, des groupes de quatre souris C3H/HeN ou C3H/HeNHsd ont reçu une injection (intrapéritonéale, ip) de 15 µg/souris d'anticorps témoins, EL-2 ou EL-6 un jour avant le placement des tiques. La description schématique de l'expérience d'immunisation est fournie sous la forme d'un panneau dans les figures principales. Après 1 jour post-immunisation, 10 tiques infectées par A. phagocytophilum ont été nourries sur chaque souris immunisée. Les tiques engorgées ont été collectées après réplétion et traitées pour des extractions d'ARN, d'ADN ou de protéines afin d'analyser l'expression des gènes immunitaires innés des tiques, la charge bactérienne et ELISA pour déterminer l'apport d'anticorps, respectivement. Les souris ont été euthanasiées au jour 7 après le placement des tiques (jour 8 après l'immunisation) et des tissus sanguins et spléniques ont été prélevés et traités pour des extractions d'ADN afin d'évaluer la charge bactérienne. Dans la deuxième série d'expériences, des groupes de quatre souris C3H/HeNHsd/groupe ont été immunisés avec des anticorps témoins, EL-2 ou EL-6 (30 µg/souris) et après le jour 1 post-immunisation, 15 nymphes non infectées ont été nourries sur chaque souris. Les tiques engorgées ont été collectées après réplétion et incubées dans une chambre environnementale pour évaluer l'efficacité de la mue. Le pourcentage de mue a été déterminé en fonction du nombre d'adultes mués par rapport au nombre de nymphes engorgées qui ont été incubées pour la mue.

Tous les travaux sur les animaux dans cette étude ont été effectués sur la base du protocole animal approuvé par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université du Tennessee (IACUC) avec le numéro de permis 2801-0221. Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé. Pour minimiser la détresse chez les animaux pendant l'alimentation des tiques, l'acépromazine a été utilisée comme tranquillisant.

La lignée cellulaire de tiques ISE 6 a été maintenue dans un milieu LI5B300 comme décrit dans nos études précédentes35,37. En bref, 2 × 105 cellules/puits ont été ensemencées dans des plaques de culture cellulaire un jour avant l'infection. Pour les infections à cellules de tiques in vitro, A. phagocytophilum a été isolé à partir de cultures HL-60 maintenues dans du milieu IMDM. A. phagocytophilum sans cellule hôte a été isolé comme décrit30,35,51. En bref, des cellules HL-60 infectées par A. phagocytophilum ont été centrifugées à 3005 g pendant 10 min. Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans du milieu IMDM et incubés dans un congélateur à -80 ° C pendant 10 min pour permettre une lyse accrue des cellules. Les cellules ont été passées à travers une seringue de calibre 27 6 à 8 fois pour libérer les bactéries. Les débris cellulaires ont été culottés par centrifugation à 270 g pendant 3 min et le surnageant a été récupéré. Pour les infections de lignées cellulaires in vitro, 2 × 105 /cellules de tique/puits ont été infectées avec A. phagocytophilum isolé à partir de 4 × 105 cellules HL-60 infectées dans une plaque de culture cellulaire à 12 puits. Pour les tests de blocage d'anticorps, 2 × 105 /cellules de tique/puits ont été étalés un jour avant le traitement avec des anticorps. Les anticorps (soit 5 ou 10 ug/ml) ont été remis en suspension dans 50 ul de PBS 1x stérile avant d'être ajoutés dans les puits de culture. Après 24 h après le traitement par anticorps, les cellules ont été infectées par A. phagocytophilum. Les cellules de tiques ont été collectées 24 h après l'infection et traitées pour les extractions d'ARN et d'ADN afin d'évaluer respectivement l'expression des gènes et la charge bactérienne.

L'immunoblot a été réalisé comme décrit30. En bref, les niveaux d'IsOATP4056 ont été analysés dans des lysats de cellules entières de tiques ou de tiques non infectées ou infectées par A. phagocytophilum avec des anticorps polyclonaux EL-2 et EL-6 de lapin. Les lysats de protéines générés à partir de tiques ou de cellules de tiques non infectées et de tiques ou de cellules de tiques infectées par A. phagocytophilum ont été dérivés de la même expérience et traités en parallèle. SDS PAGE avec 8% de gel de résolution a été utilisé et le transfert a été effectué à l'aide de Trans-Blot TurboTM (BioRad, USA) en définissant les paramètres comme Tension-25V, Courant-2,5 A et temps-7 min Les membranes de nitrocellulose transférées ont été bloquées avec 5% de BSA dans du TBST (0,05 % de Tween 20) pendant 1 heure à température ambiante et incubés pendant une nuit dans une solution d'anticorps primaire à une dilution de 1 : 1000 qui a été préparée dans du BSA à 5 %, dissous dans du TBST. Les images complètes des taches / coloration de Coomassie / coloration de Ponceau sont présentées dans la Fig. 7 supplémentaire. L'anticorps secondaire anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (Cell Signaling Technologies, USA) a été utilisé à une dilution de 1: 5000 et avec incubation pendant 1 h à température ambiante. La chimioluminescence a été mesurée à l'aide du substrat ClarityTM Western ECL, BioRad dans le système d'imagerie ChemidocTM MP (BioRad, USA). La déglycosylation des échantillons de cellules de tiques a été effectuée avec le mélange de déglycosylation protéique II (NEB-P6044S) conformément aux instructions du fabricant. En bref, 10 µg de lysat de cellules de tiques ont été mélangés avec 0,5 µl de tampon de déglycosylation 2 et incubés à 75 °C pendant 10 minutes. Après refroidissement, les échantillons ont été mélangés avec 0,5 µl de mélange de déglycosylation des protéines II et incubés à température ambiante pendant 30 min, suivis d'une incubation à 37 °C pendant la nuit et traités pour SDS PAGE et immunotransfert.

Pour déterminer la spécificité des anticorps se liant aux peptides respectifs, 100 ng de peptides EL-2 ou EL-6 (GenScript, États-Unis) ont été dissous dans du PBS 1x et appliqués sur des puits dans une plaque à 96 puits (Nunc, ThermoFisherScientific, États-Unis) et incubé une nuit à 4°C. Le peptide brouillé (GenScript, USA) a également été enrobé d'une manière similaire. Les puits vides ont été utilisés comme référence. De même, 250 ng de lysats de tiques ou de tiques non infectées ou infectées par A. phagocytophilum ont été enduits sur des plaques et incubés pendant une nuit à 4 ° C. Tous les puits ont été bloqués avec un tampon de blocage (0,1 % de Tween 20 et 1 % de BSA dans du PBS 1x) pendant 1 heure à 37 °C. 500 ng d'anticorps primaires ont été ajoutés à chaque puits après complément avec du PBS 1x contenant 0,05 % de Tween 20 et 0,5 % de BSA et incubés pendant 1 h à 37 °C. Après avoir lavé 3 fois avec un tampon de lavage (1x PBS contenant 0,05 % de Tween 20), un anticorps secondaire anti-lapin conjugué à de la peroxydase de raifort a été ajouté à une dilution de 1 : 2000 et incubé pendant 1 h à 37 °C. Après 3 lavages, 100 µl de substrat de peroxydase (Sure BlueTM, KPL, USA) ont été ajoutés et incubés pendant 15 min à 37°C. Par la suite, 50 µl de solution d'arrêt ont été ajoutés et l'absorbance a été mesurée à 450 nm dans CYTATION7 (BioTek, USA). Pour la détection d'anticorps dans des nymphes de tiques nourries, des lysats de protéines totales de tiques nourries avec EL-2 ou EL-6 ou des souris témoins immunisées avec des anticorps ont été générés dans un tampon PBS 1x contenant 1 mM de PMSF. Cinq microgrammes de chacun de ces lysats ont été ajoutés à des plaques à 96 puits revêtues de peptide EL-2 ou EL-6. Après 24 h d'incubation à 4 ° C, les plaques ont été traitées pour un traitement secondaire par anticorps suivi d'un ajout de substrat et d'une lecture d'absorbance à 450 nm.

La QRT-PCR a été réalisée comme décrit dans nos publications précédentes35,44. Les charges d'Anaplasma phagocytophilum dans les cellules de tiques, les tiques nymphales nourries ou les échantillons de souris ont été mesurées en prenant les rapports de la quantité absolue de copies du gène p44 bactérien et celle des copies respectives du gène de l'actine dans les cellules hôtes. Des courbes standard pour QRT-PCR pour chaque fragment de gène ont été préparées à partir de 1 ng à 0,00001 ng/ul. L'ADN a été extrait à l'aide du kit d'extraction de sang et de tissus DNeasy (QIAGEN, USA). Les charges de transcription de certains gènes immunitaires innés de tiques ont été exprimées sous forme de rapports entre les quantités absolues de transcriptions individuelles et celles de l'ARNr 5,8 S de la tique. L'ARN total a été extrait à l'aide du kit Aurum Total RNA Mini (BioRad, USA) et l'ADNc a été préparé à l'aide du kit de synthèse d'ADNc iSCRIPT (BioRad, USA). La QRT-PCR a été réalisée dans CFX Opus 96 (BioRad, USA) en utilisant iQ-SYBR Green Supermix (BioRad, USA) ou 2X Universal SYBR Green fast qPCR Mix (ABclonal, USA). Voici les oligonucléotides utilisés pour mesurer le transcrit de pgrp de tique : 5' CGCTACACGAGACCTTGCT 3' et 5' CGCGACGTGACTGGGGT 3'. Pour d'autres gènes, des oligonucléotides précédemment publiés ont été utilisés35,38,44.

Des cellules de tiques (2 × 104) ont été étalées dans chaque puits d'une plaque noire à fond transparent de 96 (Griener Bio One, ThermoFisherScientific, USA). Après 24 h après le placage, A. phagocytophilum a été infecté dans un groupe de cellules de tiques. Après 24 h après l'infection, les cellules de tiques non infectées et infectées par A. phagocytophilum ont été traitées pour l'immunofluorescence. Pour localiser IsOATP4056, des cellules de tiques non infectées ou infectées par A. phagocytophilum ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 %, perméabilisées dans du Triton X-100 à 0,2 % et bloquées avec du BSA à 3 %. L'anticorps EL-6 a été utilisé à une dilution de 1:250 suivi d'un traitement avec un anticorps secondaire conjugué anti-lapin-alexa594 (Molecular Probes, ThermoFisher Scientific, USA) à une dilution de 1:2500. Les cellules ont ensuite été colorées avec du DAPI (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, USA) et les images ont été capturées avec un objectif 40X dans l'imageur CYTATION7 (BioTek, USA).

Les tests Live/Dead et MTT ont été effectués comme décrit dans nos publications précédentes46,52. En bref, 3 × 104 cellules de tiques ont été étalées dans chaque puits d'une plaque à 96 puits (Griener Bio One, ThermoFisherScientific, USA). Après un jour d'ensemencement, les cellules ont été traitées avec 5 ug/ml ou 10 ug/ml d'anticorps EL-2 ou EL-6. Après un jour de traitement par anticorps, des tests de mort cellulaire ont été effectués. Dans le cas du test Live/Dead (LIVE/DEADTM Cell Imaging kit, Invitrogen), les contenus des flacons vert et rouge ont été mélangés selon les instructions et ajoutés au milieu de culture à une dilution au 1/4. Après 15 minutes d'incubation, les cellules ont été imagées pour la fluorescence à l'aide d'un objectif 20X dans l'imageur CYTATION7 (BioTek, USA). Dans le cas du test MTT, 5 mg/ml de réactif MTT (Sigma, USA) dans du PBS 1x ont été ajoutés aux cellules à 10 % du volume total. Les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 4 h et du DMSO a été ajouté à la moitié du volume de milieu de culture. Après mélange pendant 5 min, l'absorbance à 570 nm et 690 nm a été mesurée. Les valeurs à 690 nm ont été soustraites des valeurs respectives à 570 nm et des graphiques ont été tracés.

La synthèse fictive ou myd88-dsRNA a été réalisée comme décrit35,38. En bref, le fragment myd88-ARNdb a été généré par PCR en utilisant 5' CCAGATCTGTCCATCAAGAGCAGTGGCA 3' et 5' CGGGTACCACCATTGTGAAGGAGCACCA 3' contenant les sites BglII et KpnI, respectivement. Le produit de PCR obtenu a été cloné dans le vecteur pL4440 double T7 Script II comme décrit29,30. Le clone obtenu a ensuite été traité pour la synthèse d'ARNdb à l'aide du kit MEGAscript RNAi (Ambion Inc.) en suivant les instructions du fabricant. La transfection de myd88-dsRNA dans des cellules de tiques ISE6 a été réalisée avec 2 microlitres de réactif de transfection FuGENE 6 (Promega, USA) comme décrit35,38. Brièvement, 2 x 105 cellules ont été étalées dans une plaque 12 puits en milieu L15B300. Après une nuit d'incubation, 750 ng d'ARNdb myd88 ont été mélangés avec le réactif de transfection FuGENE 6 et ont été ajoutés à chaque puits. Après 4 heures, 2 x milieu L15B300 ont été ajoutés avec ou sans anticorps EL-6 et incubés pendant une nuit. Après incubation, A. phagocytophilum sans cellule a été ajouté et des échantillons ont été prélevés 24 h après l'infection. Les échantillons ont été traités pour l'extraction d'ARN et d'ADN afin de quantifier l'expression de myd88 et la charge bactérienne, respectivement.

Tous les ensembles de données ont été analysés statistiquement à l'aide du logiciel GraphPad Prism 5 (www.graphpad.com). Le test t de Student non apparié a été considéré pour comparer les ensembles de données expérimentales avec deux variables. les valeurs de p <0,05 sont considérées comme significatives.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires).

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Les réactifs suivants ont été obtenus auprès de BEI Resources, NIAID, NIH : Ixodes scapularis Larvae (Live), NR-44115 et Anaplasma phagocytophilum, Strain NCH1, NR-48807. Cette étude a été soutenue par un financement du National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), des National Institutes of Health (NIH) (numéro de prix : R01AI130116) au GN et de l'Université du Tennessee, fonds de Knoxville au HS et au GN.

Département des sciences biomédicales et diagnostiques, Collège de médecine vétérinaire, Université du Tennessee, Knoxville, TN, États-Unis

PP Mahesh, Prachi Namjoshi, Hameeda Sultana et Girish Neelakanta

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PPM, PN et GN ont réalisé les expériences. PPM, PN, HS et GN ont analysé les données. PPM, HS et GN ont conçu l'étude, HS et GN ont fourni les réactifs. Tous les auteurs ont lu, édité et approuvé le manuscrit. PPM et GN ont rédigé l'article. GN a conceptualisé et conçu l'étude et supervisé les investigations globales.

Correspondance à Girish Neelakanta.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Mahesh, PP, Namjoshi, P., Sultana, H. et al. L'immunisation contre la protéine d'arthropode altère la transmission de l'agent pathogène rickettsie des tiques à l'hôte vertébré. npj Vaccins 8, 79 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00678-y

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Reçu : 16 septembre 2022

Accepté : 16 mai 2023

Publié: 30 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41541-023-00678-y

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